зразків і реагентів. Пробозабірник реагентів (RPP1) спочатку додає деіонізовану воду або спеціальний ділюент в реакційну кювету. Далі, пробозабірник зразків віддає зразок в ту ж саму кювету і розчин перемішується міксерної лопаткою (MIX - 1). Потім пробозабірник реагентів (RPP1) відправляє R1 в нову реакційну кювету, а пробозабірник зразків відбирає перемішаний зразок з першої реакційної кювети і відправляє його в кювету, що містить реагент R1. Реакційна суміш перемішується міксером (MIX - 1). Якщо потрібно другий реагент, пробозабірник реагентів (RPP2) відправляє реагент R2 в ту ж саму кювету і розчин перемішується знову міксером (MIX - 2). Результати аналізу роздруковуються, можна їх переглянути і в системі.
2.2.1 Визначення активності альфа - амілази
Історично першим біохімічним способом діагностики панкреатитів є найбільш поширений діагностичний тест вивчення рівня амілази в крові (сечі). У 1908 р Вольгемут розробив метод визначення активності амілази в біологічних рідинах, відтоді запропоновано понад 200 методичних прийомів.
За методикою IFCC використовується етиліден-pNP-G7 (E -pNP-G7) в якості субстрату (1). Після розщеплення субстрату? - Амілазою утворилися дрібні фрагменти ланцюга гідролізуються? - Глюкозидази, що викликає виділення хромофора. Активність? - Амілази визначається за ступенем збільшення поглинання світла розчином при 405 нм в результаті утворення п-нітрофенолу (2).
Принцип методу: ферментативний колориметричний тест з 4,6етілен (G7) -п-нітрофеніл (G1) -?, D- мальтогептозідом (етиліден-G7ПНФ) в якості субстрату:
етиліден-G7ПНФ + 5H2O-? - амілаза ----- gt; 2-етиліден-G5 + 2G2ПНФ + (1)
+ 2-етиліден-G4 + 2G3ПНФ + етіліденG3 + G4ПНФ
G2ПНФ + 2G3ПНФ + 10 H2O-? - глюкозидаза ----- gt; 4ПНФ + 10G (2)
(ПНФ=п-нитрофенол, G=глюкоза)
Реагент в наборі готовий до використання. Перед установкою реагенту на борт аналізатора, необхідно впевнитись у відсутності бульбашок у флаконі і на поверхні реагенту.
Активність ферменту в сироватці крові в нормі 30,0-118,0 Е/л.
2.2.2 Визначення активності глюкози глюкозооксидазним методом
У цьому методі використовується глюкозооксидаза (РІК) (3) і модифікована кольорова реакція Тріндера, катализируемая ферментом пероксидазою (ПІД) (4). Глюкоза окислюється до D-глюконату за допомогою глюкозооксидази з утворенням еквімолярної кількості пероксиду водню. У присутності пероксидази між 4-аміноантипірину і фенолом відбувається реакція окислювального з'єднання з участю пероксиду водню з утворенням хінонімінного барвника червоного кольору. Інтенсивність утворення кольору при реакції вимірюється при 510 нм і є прямо пропорційною концентрації глюкози у зразку.
Глюкоза + О2 --- РІК ---- gt; глюконова кислота + H2O2 (3)
H2O2 + 4-аміноантипірину + фенол - ПІД ----- gt; червоний хінонімін + 4H2O (4)
Нормальна концентрація глюкози в крові становить - 3,5-6,38 ммоль/л.
2.2.3 Визначення активності ліпази
ензиматичного колориметричний тест. Штучно синтезований субстрат ліпази (ефір 1,2-о-діалуріл-рас-гліцеро - 3-глутаровой кислоти, 6-метілрезоруфін) доданий до мікроемульсії (5), специфічно виділяє ліпазу у присутності ко-ліпаз і жовчних кислот. Комбінація ко-ліпаз і жовчних кислот робить цей тест специфічним і надійним для визначення панкреатичної ліпази і виключає інтерференцію, яку міг би викликати ліполіз ферментів або ефірів. Склад реагенту ретельно оптимізований для виключення впливу сироваткового матриксу. Штучно створений метілрезоруфін-ефір мимовільно розпадається з утворенням метілрезоруфіна. Абсорбція цього барвника червоного кольору прямо пропорційна активності ліпази в пробі. Ліпаза є каталізатором цієї реакції.
, 2-о-діалуріл-рас-гліцерин +
+ ефір глутаровой кислоти (6 метілрезоруфін) ----- gt; (5)
---- gt; глутарова кислота + метілрезоруфін.
Наростання абсорбції вимірюється фотометрически. Реагент повністю готовий до використання.
Межі норм вмісту ліпази в сироватці крові становлять - 13-60Ед/л.
2.2.4 Визначення загального білірубіну в сироватці крові
Принцип методу: колориметричне визначення з діазореагентом (DPD) і детергентом в кислому середовищі. Незв'язаний білірубін вивільняється за допомогою поверхнево-активної речовини і HCl. Далі білірубін зв'язується з сіллю п-нітробензолдіазонія (NBD) c утворенням азобілі...
