вердофазного иммуноанализа - непрямий іммуноаналіз, прямий іммуноаналіз і іммуноаналіз сендвіч-типу. Відмінності між цими типами иммуноанализа полягають у наступному. У непрямому варіанті иммуноанализа на першій стадії на поверхню лунок полістирольного планшета сорбируется антиген. Після видалення несвязавшихся молекул антигену додається зразок, що містить специфічні до даного антигену антитіла. Утворені комплекси антиген-антитіло детектируются за допомогою анти-видових антитіл, кон'югованих з якою-небудь міткою (Мал. 1А). У прямому варіанті іммунаналізадетекція сорбованої антигену здійснюється безпосередньо за допомогою специфічних антитіл, кон'югованих з міткою (Мал. 1Б). У іммуноаналізесендвіч-типу на першій стадії на поверхню планшета сорбируется НЕ антиген, а антитіла, специфічні до досліджуваного антигену (антитіла підкладки). Після видалення не пов'язаного молекул антитіл додається зразок, що містить антиген. Для детекції утворився комплексу антитіла підкладки-антиген додаються другі антитіла, специфічні до іншого, просторово віддаленого, епітопу антигену, кон'юговані з якою-небудь міткою. Використання в імуноаналізі сендвіч-типи антитіл, специфічних до двох різних епітопів антигену, дозволяє добитися високої чутливості і специфічності при визначенні антигену навіть в таких гетерогенних зразках, як плазма крові.
Непрямий імуноферментний аналіз (indirect ELISA).
Метод непрямого іммуноаналза характеризується здійсненням 3-х стадійного процесу, на першій стадії якого антиген адсорбується на спеціально підготовленому пластиці, на другому з антигеном взаємодіють специфічні до нього антитіла, а на третьому в систему вводять антивидові антитіла, кон'юговані з ферментом, що обумовлює проведення індикаторної ферментативної реакції. У даній методиці як ферменту використовують пероксидазу хрону. Реакція проводиться в спеціальних 96-лункових планшетах.
1. Сорбція антигену
В лунки 96-лункового планшета для проведення иммуноанализа сорбували антиген 0,1-0,5 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-сольового буфера (PBS). Інкубація проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів.
Відмивання (2-х кратна) несвязавшихся молекул антигену здійснюється фосфатно-сольовим буфером містить 0.1% Tween - 20 (PBSТ). . Блокування
Для блокування місць неспецифічного зв'язування лунки планшета заповнюють PBST і інкубують протягом 10-15 хвилин при кімнатній температурі.
. Растітровка специфічних антитіл
Растітровку можна проводити як по горизонтальних, так і по вертикальних рядах планшета. Необхідно відзначити, що растітровка антитіл проводиться в тому випадку, якщо необхідно підібрати оптимальну концентрацію антитіл або визначити титр. У тому випадку, якщо оптимальна концентрація і / або титр антитіл визначені, то використовують рекомендоване для даних конкретних антитіл розведення.
При растітровке в першу лунку ряду вносять готове розведення антитіл - в середньому 1-10 мкг в лунку, далі проводять послідовне розведення антитіл в лунках. Інкубацію зі специфічними антитілами проводять протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів.
Відмивання здійснюється за допомогою PBSТ 3 рази.
