я випромінювання при високій концентрації речовини в комірці, а також на втрату випромінювання за рахунок відображення від віконець осередки. Тому при роботі з Флуоріметри слід використовувати досить розбавлені розчини, крім того, можливе застосування детекторів без віконець, наприклад з Ні-Cd-лазером.
Деякі нефлуоресцірующіх з'єднання поділяють у вигляді похідних з флуорогеннимі речовинами. Похідні отримують до хроматографічного поділу або після, вводячи реагент в Т-подібне пристрій між колонкою і детектором. Аміни і феноли утворюють діазільние похідні при взаємодії з 5-диметил-аміно-1-нафтілсульфохлорідом до поділу, а амінокислоти після поділу обробляють флуорескаміном.
Флуоріметри застосовують при аналізі мікродомішок, коли мала концентрація розчиненого речовини, підлягає виявленню. Хоча динамічний діапазон флуориметра досить великий (10 4 ), його лінійний динамічний діапазон може бути обмежений для деяких розчинених речовин відносно вузьким інтервалом концентрацій (10-кратним). Для кількісного аналізу його слід перевіряти в сюжеті інтервалі концентрацій.
Перед кількісним виміром необхідно переконатися в відсутність фонової флуоресценції, ефектів гасіння та перевірити відгук детектора на реальний зразок.
кисневмісних розчинники гасять флуоресценцію, і їх так само як і елюентом, поглинають світло в області порушеної випромінювання, не можна застосовувати. Галогеновмісні розчинники (хлороформ і метилен) повинні бути використані з обережністю, оскільки мають тенденцію послаблювати флуоресценцію. Якщо в розчиннику немає флуоресціюючих речовин, флуориметр може працювати в градієнтному режимі. Флуориметр менше, ніж інші детектори, залежить від змін температури або тиску. Однак зменшення температури або збільшення в'язкості деяких розчинників ускладнює флуоресценцію.
1.4.5 Інші детектори
Крім детекторів, описаних вище, для ВЕРХ використовують і інші прилади: електрохімічний, інфрачервоний, детектор з діодним матрицею, мас-спектрометричний, транспортний з полум'яно-іонізаційним детектуванням, радіоактивний, по діелектричної проникності, електронозахватний, кулонометрический та ін Одні з них мають високу селективність або чутливістю, інші дають важливу якісну інформацію. Розглянемо більш детально деякі з них. br/>
Рис. 1.14. Електродна осередок електрохімічного детектора: 1 - вихід колонки, 2 - до електрода порівняння; 3 - фтороплатовая прокладка, 4 - робоча камера кювети; 5 - робочий електрод; 6 - блок осередку
В
Електрохімічний детектор . Цей детектор можна застосовувати для аналізу всіх речовин, що володіють електрохімічної активністю, тобто спосіб при певному потенціалі окислюватися або відновлюватися, відповідно віддаючи або приймаючи гектрони. У водних розчинах ці потенціали можуть бути від +1,2 До -0,8 В (електрод порівняння - хлорсрібний). p> Речовини, містять фенольну, індольне або альдегідну групи, здатні окислюватися при низьких потенціалах (0,4-0,7 В), а речовини з нітро-чи кетогруппу - відновлюватися. Так, важливі в біології класи речовин - катехоламіни і 5-гідроксііндоли - у цих умовах здатні окислюватися, віддаючи два е. лектрона. При цьому і виникає струм в кюветі детектора, який потім посилюється амперометричним детектором.
Електродна осередок (кювету), схема якої представлена ​​на малюнку 1.14, складається з двох блоків, розділених фторопластовою прокладкою з вирізом, які представляють собою робочу камеру. У центрі камери розташований тонкошаровий електрод (анод) зі скловуглецю. Електрод порівняння розміщується на виході з осередку. Місткість робочої камери 1 мкл, що дозволяє працювати з микроколонки. p> Електрохімічний детектор більш селективен при низьких потенціалах робочих електродів. Для 5-гідроксііндолов потрібен потенціал 0,5-0,55 В, для катехоламінів - 0.5-0,7 В, для пептидів - 0,9-1,2 В. Чутливість і специфічність електрохімічного детектора високі. За чутливості вони не поступаються кулонометр-ного детекторам, хоча окислююча здатність тонкошарових електродів з робочою поверхнею 2-4 мм 2 становить лише 1-10% від кількості аналізованого речовини. Нижня межа детектування катехоламінів і 5-гідроксііндолов становить від 5 до 20 пг введеного в колонку речовини. На рис. 8.15 наведена хроматограмма 5-гідроксііндолов з солянокислого екстракту 0,5 мл плазми крові. p> При роботі з електрохімічним детектором необхідно враховувати наступне. Фонові шуми тим нижче, чим чистіше використовувані реактиви, тому фосфати потрібно очищати перекристаллизацией, використовувати ВИСОКОЧИСТИХ воду і розчинники марок В«осчВ» або для ВЕРХ. Шліфувати поверхні робочого електрода слід в міру його забруднення і збільшення шумів не частіше 1 разу на місяць з наступним промиванням його 50%-ним метанолом. Обов'язковим є хороше дегазації розчинників, бажано продувкою гелієм.
Електрохімічний детектор знаходить застосування в аналізі катехоламінів, с...
