10 мл венозної крові. Зразок витримати при кімнатній температурі протягом 30 хв. Пробірку не пізніше, через 1 год після взяття крові протягом 10 хв центрифугувати при швидкості 1500g. Сироватку перенести автоматичним дозатором з наконечником 1000 мкл у дві поліпропіленові пробірки об'ємом 1,5 мл типу «Eppеndorf». Зразки помістити в морозильну камеру, заморозити до - 20 ° С і зберігати при даній температурі до 1 міс. аж до проведення кількісного аналізу змісту ацетізоніазіда і ізоніазиду. Температуру в морозильній камері контролювати за допомогою термометра [78].
Б. Підготовка зразків сироватки крові
Підготовку проб сироватки крові проводити методом осадження білка. До 1 мл зразка сироватки крові додати 0,5 мл 10% трихлороцтової кислоти. Суміш ретельно перемішати протягом 1 хв, помістити в центрифугу і центрифугувати протягом 10 хв при 3000 оборотів / хв. Після цього для нейтралізації надлишку трихлороцтової кислоти до 0,5 мл надосадової рідини додати 0,5 мл 0,5 М (рН 8, 20) розчину ацетату амонію. Обсяг введеної проби повинен скласти 10 мм3. Для кожного зразка виконати три інжекції.
Вихідний розчин ізоніазиду готують шляхом розчинення точної наважки стандартного зразка ізоніазиду, складовою 100,0 мг, в мірній колбі місткістю 100 мл. Як розчинник слід використовувати воду для хроматографії. Концентрація вихідного розчину повинна скласти 1000 мкг / мл.
Робочий розчин приготувати з вихідного розчину ізоніазиду. Концентрація робочого розчину повинна скласти 50 мкг / мл.
Градуювальні розчини різних концентрацій ізоніазиду зробити з робочого розчину шляхом розведення сироваткою крові, вільної від лікарських речовин. Орієнтовна концентрація градуювальних розчинів ізоніазиду повинна становити 0,5-1,0-2,0-5,0-12,0 мкг / мл [78].
1.3.4.2 Підготовка хроматографа та проведення аналізу
А. Умови хроматографічного розділення
Поділ проводили в градієнтному режимі.
Установити такі параметри хроматографічного розділення:
швидкість потоку 1,2 мл / хв;
тиск 100-120 бар;
довжина хвилі детектора 275 нм;
температура термостата колонки 20 ± 1 ° С;
температура пристрої для введення зразків +4 ° С;
час хроматографування: 3-кратне час утримування основного
піку на хроматограмі випробуваного розчину.
Б. Проведення хроматографічного аналізу
Переконатися в стабільності швидкості потоку рухомої фази і температури колонки. Впорснути по 10 мм3 випробуваного розчину. Отримати хроматографічні криві. Час виходу ізоніазиду має скласти 2,8 ± 0,1 хв., Ацетізоніазіда - 2,3 ± 0,1 хв. Співвідношення часу виходу ацетізоніазіда до часу виходу ізоніазиду має коливатися від 0,83 ± 0,03.
1.3.4.3 Визначення фенотипу N-ацетилювання
Фенотип ацетилювання визначають як швидкість ацетилювання ізоніазиду і розраховують як відношення концентрацій ацетізоніазіда до ізоніазиду (відношення R).
Залежно від інтервалу відносини R: [0-0.28]; [0.28-0.37]; [0.37-1]...
