lign="justify"> З Escherichia coli виокремлює плазмиду відповідної рестриктазой. синтетичний ген вбудовується в плазміду (клонуванням з функціонально активної С-кінцевий частиною? - галактозидази Escherichia coli). У результаті Escherichia coli набуває здатність синтезувати білкову ланцюг, що складається з галактозидази і інсуліну. Синтезовані поліпептиди отщепляют від ферменту хімічним шляхом, потім проводять і очистку. У бактеріях синтезується близько 100 000 молекул інсуліну на бактеріальну клітину.
Природа гормонального речовини, продуцируемого Escherichia coli, обумовлена ??тим, який ген вбудовується в геном одноклітинного організму. Якщо клонований ген попередника інсуліну, бактерія синтезує попередник інсуліну, який піддається потім обробці рестриктазами для відщеплення препітіда з виокремлення С-пептиду, внаслідок чого виходить біологічно активний інсулін.
Для отримання очищеного інсуліну людини виділений з біомаси гібридний білок піддають хіміко-ферментативної трансформації і відповідної хроматографічної очищенні (фпрнтальной, гельпронікающей, аніонообмінної).
В Інституті РАН (Російська академія наук) отриманий рекомбінантний інсулін з використанням генно-інженерних штамів Escherichia coli з вирощеної біомаси виділяється попередник, гібридний білок, експрессіруемий в кількості 40% від усього клітинного білка, що містить препроинсулин. Перетворення його на інсулін in vitro (технологія виконання експериментів, коли досліди проводяться «в пробірці» - поза живого організму) здійснюється в тій же послідовності, що і in vivо, (тобто «всередині живого організму» або «всередині клітини») - відщеплюється лідируючий поліпептид, препроинсулин перетворюється на інсулін через стадії окислювального сульфітоліза з подальшим відновним замиканням трьох дисульфідних зв'язків і ферментативним вичленовуванням зв'язує С-пептиду. Після низки хромотографіческіх очисток, що включають іонообмінні, гелеві та ВЕРХ (високоефективна рідинна хроматографія), отримують людський інсулін високої чистоти і природної активності.
Можна використовувати штам з вбудованою в плазміду нуклеотидної послідовністю, експресує гібридний білок, який складається з лінійного проінсуліна і приєднаного до його N-кінця через залишок метіоніну фрагмента білка А Staphylococcus aureus (Стафілокок золотистий).
Культивування насиченою біомаси клітин рекомбінантного штаму забезпечує початок виробництва гібридного білка, виділення і послідовна трансформація якого призводять до інсуліну.
Можливий і інший шлях: виходить в бактеріальної системі експресії злитої рекомбінантний білок, що з проінсуліна людини і приєднаного до нього через залишок метіоніну полігістідінового «хвоста». Його виділяють, використовуючи хелатную хроматографію на колонках з Ni-агарози з тілець включення, і розщеплювали бромцианом.
Виділений білок є S-сульфонірованним. Картування і?? ас-спектрометричний аналіз отриманого проінсуліна, очищеного ионнообменной хроматографією на анионите і ОФ (обращённофазовой) ВЕРХ, показують наявність дисульфідних містків, відповідних дисульфідні містках нативного проінсуліна людини.
Останнім часом пильна увага приділяється спрощенню процедури отримання рекомбінантного інсуліну методами генної інженерії. Так, наприклад, можна отримати злитої білок, що з лідерних пептиду інтерлейкіну 2 приєднаного до N-кінця проінсуліна, через залишок лізину. Білок ефективно експресується і локалізується в тільцях включення. Після виділення білок розщеплюється трипсином з отриманням інсуліну та С-пептиду.
Отримані інсулін і С-пептид очищалися ОФ ВЕРХ. При створенні злитих конструкцій досить істотним є співвідношення мас білка носія та цільового поліпептиду. С-пептиди з'єднуються за принципом «голова-хвіст» за допомогою амінокислотних спейсеров, несучих сайт рестрикції Sfi I і два залишку аргініну на початку і в кінці спейсера для подальшого розщеплювання білка трипсином. ВЕРХ продуктів розщеплення показує, що відщеплення С-пептиду проходить кількісно, ??а це дозволяє використовувати спосіб мультімерной синтетичних генів для отримання цільових поліпептидів в промисловому масштабі. [12, стр.10-15]
. 16 Лікарські форми і системи доставки інсуліну
Порошок для ін'єкцій: підшкірно - при повсякденному прийомі, внутрішньовенно і інтраперітоніально - при комі
Суспензії для підшкірного введення.
Розчини для ін'єкцій:
портативний інжектор у вигляді авторучки (для багаторазових підшкірних ін'єкцій при інтенсивній інсулінотерапії)
системи з «замкнутим колом» (інфузійні системи контролюють рівень глюкози в крові; тільки при діабетичній комі)
сист...
