ористовували кДНК BHK, отримана шляхом зворотної транскрипції сумарною РНК, виділеної з клітин лінії BHK і очищена від ДНК ДНКаза I. Як негативний контроль бралася вода. Ампліфікацію проводили при температурі відпалу 57 Вє С і концентрацією компонентів:
Таблиця 5. Склад РС для ПЛР. p align="justify"> КомпонентКонцентрація або кількість у РСБуфер для ПЦР1 хdNTP0, 3 мМПрямой праймер5 мкМОбратний праймер5 мкМTaq-pol0, 1 Е.А./мкл
Візуалізацію продуктів ПЛР проводили за допомогою методу електрофорезу в агарозному гелі. За відносної інтенсивності бендів судили про відносну ефективність ампліфікації. br/>
2.11.2 Підбір оптимальних температури відпалу і концентрації хлориду магнію
Готували 24 реакційні суміші, кожній з яких для зручності і наочності було присвоєно умовну назву. Назви реакційних сумішей наведені в таблиці 6. br/>
Таблиця 6. Позначення реакційних сумішей
праймериматріцаС Mg2 + , мМТемпература відпалу, Вє С55, 55759,561 EGFP-3, 2H 2 O5 В«11В» В«21В» В«31В» В«41В» кДНК align = "justify"> 2 O5 В«15В» В«25В» В«35В» В«45В» кДНК BHK1, 5 В«16В» В«26В» В«36В» В«46В» 3 В« 17 »« 27 »« 37 »« 47 В»5В« 18 »« 28 »« 38 »« 48 В»
Для кожної реакційної суміші проводили ПЛР. Візуалізацію продуктів ПЛР проводили за допомогою методу електрофорезу в агарозному гелі. За відносної інтенсивності бендів судили про відносну ефективність ампліфікації. p align="justify"> 2.11.3 Підбір оптимальних концентрацій дезоксинуклеозидтрифосфатов і праймерів
Готували 10 реакційних сумішей з різними умовами проведення реакції. Для зручності і наочності кожної реакційної суміші привласнювали умовна назва. Контрольний експеримент (реакційна суміш В«0В») проводили при максимальній концентрації праймерів (0,5 мкМ) і dNTP (1 мМ) у відсутність ДНК-матриці. Назви реакційних сумішей, що містять матрицю наведені в таблиці 7. br/>
Таблиця 7. Позначення реакційних сумішей. p align="justify"> З dNTP , мкМ З праймерів , мкМ5025010000, 15 В«1В» В«2В» В«3В» 0,3 В«4В» В«5В» В«6В» 0,5 В«7В» В«8В» В«9В»
Для кожної реакційної суміші проводили ПЛР. Візуалізацію продуктів ПЛР проводили за допомогою методу електрофорезу в агарозному гелі. За відносної інтенсивності бендів судили про відносну ефективність ампліфікації. br/>
3. Результати та обговорення
Метод придуш...
