ВИДІЛЕННЯ БІЛКІВ
Виділення практично чистого індивідуального білка (у таких випадках нерідко вживають не цілком вдалий термін "гомогенний білок ") - необхідна передумова для вивчення його будови і функціональних властивостей. Технічні прийоми, використовувані для цього, вельми різноманітні і швидко удосконалюються, причому поряд з розвитком мікрометодів все частіше виникає необхідність масштабування процесів, з тим, щоб отримувати великі кількості високоочищених білків для потреб медицини та біотехнології. Особливо загострилася потреба в ефективних методах розділення білків з розвитком генно-інженерних способів їх отримання. У даній главі розглянуті лише найбільш загальні принципи препаративної хімії білків.
В
Особливості виділення білків
Отримання чистих хімічних індивідуальних білків включає в себе як видалення небілкових домішок, так і поділ між собою власне білкових компонентів. Остання частина завдання в силу подібності фізико-хімічних властивостей білків особливо складна, тому саме її рішення визначає вибір тих чи інших схем виділення білка. При цьому необхідно враховувати деякі особливості поведінки, притаманні усім білкам.
До них відноситься, насамперед, здатність білків піддаватися денатурації , тобто зазнавати такі зміни просторової будови, які призводять до втрати або часткової втрати функціональних властивостей. Правда, денатурація в багатьох випадках оборотна, однак ця оборотність НЕ забезпечується автоматично, а вимагає в кожному окремому випадку підбору спеціальних прийомів. У той же час повністю або навіть частково денатуровані білки дуже вразливі для незворотних ушкоджень, особливо для дії протеолітичних ферментів, тому умов, що сприяють денатурації, варто всіляко уникати.
Для запобігання теплової денатурації виділення білка проводять при низькій температурі, зазвичай при 4 Вє С. Необхідно також уникати крайніх значень pH. Білки легко денатурують при низьких рН через протонування негативно заряджених в нормальних умовах карбоксильних груп і виникає внаслідок цього різкого переважання позитивних зарядів, яке сприяє розгортанню компактної структури. У лужному середовищі при рH 10 і вище втрачаються позитивні заряди, зумовлені протонуванням Оµ-аміногруп лізину, і знову-таки настає декомпенсація зарядів на поверхні, дестабілізуюча глобулу. Одночасно фенольні гідроксили тих залишків тирозину, які були приховані всередині глобули, отримавши негативний заряд, прагнуть вийти на поверхню, що також сприяє денатурації білка.
У ще більш лужних розчинах відбуваються реакції, необоротно пошкоджують білок , - відщеплення сірки від залишків цистеїну і цистину, ОІ-елімінування фосфатних залишків у фосфопротеинов, відщеплення полісахаридних ланцюгів, приєднаних до залишків серину в глікопротеїну. Утворені в результаті цих реакцій залишки непредельной амінокислоти - дегідроаланіна - приєднуються до прилеглих Оµ-аміногрупи лізину з утворенням так званого лізіноаланіна - сполуки, присутність якого в кислотному гід-ролізате білка свідчить про глибоке пошкодженні його структури.
В
Причиною денатурації може стати застосування органічних розчинників, здатних порушити істотну для стабільності білка систему гідрофобних контактів усередині глобули. Треба також враховувати можливість денатурації білка на межі розділу фаз, Особливо при утворенні піни. При виділенні дуже малих кількостей білка, що не рідкісному в сучасній біохімії, слід рахуватися з втратами, викликаними його адсорбцією , часто незворотною, на поверхні скла або полімерних матеріалів, особливо значною на заключних стадіях очищення.
Особливу небезпеку при виділенні білків представляють містяться в вихідному матеріалі протеолітичні ферменти, навіть якщо вони присутні в слідових кількостях. Пошкодження, яке призводить до утворення помилкових множинних форм білка, а іноді і його глибоке розщеплення стають особливо ймовірними, якщо схема виділення включає умови, що наближають білок до денатурації. Для запобігання протеолізу необхідно вже на ранніх стадіях очищення включати операції, спрямовані на відділення протеїназ, додавати до суміші інгібітори різних класів протеїназ. Дуже важливо проводити очищення білка швидко, що знижує небезпеку протеолізу та ймовірність денатурації.
Поширена думка про особливу нестабільності чистих білків. Дійсно, містяться в неочищених препаратах сторонні білки в певній мірі захищають білок від денатуруючих впливів та протеолізу. На проміжних стадіях, коли повна
очищення ще досягнуто, небезпека протеолізу збільшується, з видаленням ж слідів протеїназ на завершальних етапах очищення стабільність білка повинна знову зрости. Втім, зростає і небезпека сорбційних втрат на поверхнях, які можуть сприйматися експериментатором як притаманна чистому білку нестабільність.
Характерні властивості білків, на яки...
