tify"> геліказу - необхідний для розкручування подвійної спіралі ДНК з формуванням одноцепочечной структури, яка забезпечує реплікацію обох ланцюжків відповідно до напівконсервативної моделлю реплікації ДНК.
Деякі ДНК-полімерази володіють також здатністю виправляти помилки у знову збирається ланцюжку ДНК. Якщо відбувається виявлення неправильної пари нуклеотидів, ДНК-полімераза відкочується на один крок назад, виключає з неправильний нуклеотид з ланцюжка, потім вставляє на його місце правильний, після чого реплікація продовжується в звичайному режимі.
1.2 Проведення ПЛР
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - метод ампліфікації ДНК, за допомогою якого протягом декількох годин можна виділити і розмножити певну послідовність ДНК в мільярди разів. Можливість отримання величезної кількості копій одного строго певної ділянки геному значно спрощує дослідження наявного зразка ДНК.
Для проведення полімеразної ланцюгової реакції необхідне дотримання ряду умов. Для проведення ПЛР у найпростішому випадку потрібні наступні компоненти:
ДНК-матриця, що містить ту ділянку ДНК, який потрібно ампліфікувати.
Два праймера, комплементарні кінцям необхідного фрагмента. (Пара штучно синтезованих олігонуклеотидів, що мають, як правило, розмір від 15 до 30 п. Н., Ідентичні відповідним ділянках ДНК-мішені. Вони відіграють ключову роль в утворенні продуктів реакції ампліфікації. Правильно підібрані праймери забезпечують специфічність і чутливість тест-системи.)
Термостабільна ДНК-полімераза. Полімераза, використовувана в ПЛР, повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофілів - Thermus aquaticus (Taq-полімераза) та інші.
Дезоксінуклеотідтріфосфати (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Іони Mg 2+, необхідні для роботи полімерази.
Буферний розчин, що забезпечує необхідні умови реакції - pH, іонну силу розчину. Містить солі, сироватковий альбумін.
Щоб уникнути випаровування реакційної суміші, в пробірку додають висококиплячих масло, наприклад, вазелінове. Якщо ж використовується прилад з підігрівають кришкою, цього робити не потрібно.
Додавання пірофосфатази може збільшити вихід ПЛР-реакції. Цей фермент каталізує гідроліз пірофосфату, побічного продукту приєднання нуклеозидтрифосфатів до зростаючої ланцюга ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат може інгібувати ПЛР-реакцію.
Для багаторазового збільшення кількості копій вихідної ДНК потрібна циклічність реакції. Як правило, кожен з послідовно повторюваних циклів ПЛР складається з трьох етапів:
. Денатурація, або плавлення ДНК. Двухцепочечную ДНК-матрицю нагрівають до 94 - 96? С (або до 98? С, якщо використовується особливо термостабильная полімераза) на 0,5 - 2 хвилини, щоб ланцюга ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією, так як руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами ДНК. Іноді перед першим циклом (до додавання полімерази) проводять попередній прогрів реакційної суміші протягом 2 - 5 хвилин для повної денатурації матриці і праймерів. Такий прийом називається гарячим стартом , він дозволяє знизити кількість неспецифічних продуктів реакції.
. Відпал - зв'язування праймерів з матричної ДНК . Коли ланцюга розійшлися, температуру повільно знижують, щоб парймери могли зв'язатися з одноцепочечной матрицею. Температура відпалу залежить від складу праймерів і зазвичай вибирається 50-65? С. Час стадії - 20 - 60 секунд. Неправильний вибір температури відпалу приводить або до поганого зв'язування праймерів з матрицею (при підвищеній температурі), або до зв'язування в невірному місці і появі неспецифічних продуктів (при заниженій температурі).
. Синтез (елонгація ланцюга). ДНК-полімераза реплікує матричну ланцюг, використовуючи праймер як затравки raquo ;. Полімераза починає синтез другого ланцюга від 3'-кінця праймера, який зв'язався з матрицею і рухається уздовж матриці. Температура елонгації залежить від полімерази. Часто використовувані полімерази Taq і Pfu найбільш активні при 72? С. Час синтезу залежить від типу ДНК-полімерази і від довжини амплифицируемого фрагмента. Зазвичай час елонгації приймають рівним одній хвилині на кожну тисячу пар основ. Після закінчення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації , щоб добудувати всі одноланцюжкові фрагменти. Ця стадія триває 7 - 10 хвилин.
Надалі етапи денатурації, відпалу та елонгації багаторазово повторюються (30 і більше разів). На кожному ци...
