де З - молярна концентрація, а l - Довжина оптичного шляху. p> У разі білків головною метою вимірювання спектрів КД є визначення вмісту в них вторинних структур різних типів. Якщо частка ароматичних амінокислот у білку не дуже велика, його оптична активність в області від 180 до 240 нм визначається головним чином поліпептидним остовом. Численні експерименти показали, що аліфатичні бічні групи амінокислотних залишків білка теж не дають помітного внеску в спектр КД в цій області. Отже, в першому наближенні білкову молекулу можна розглядати просто як комбінацію ділянок поліпептидним остова, що знаходяться в конформаціях a-спіралі, b-структури і безладного клубка.
Поглинання світла пептидного групою
В
в ультрафіолетовому діапазоні визначається електронними переходами в її електронних оболонках. У цьому процесі основну участь приймають три молекулярних орбіталі пептидної групи: n-орбіталь - несвязивающая орбіталь, на якій розташовується неподіленої пара 2p y -електронів атома кисню, p-орбіталь - зв'язує орбіталь, на якій розташовуються 2p z -електрон атома кисню і 2p z -електрон атома вуглецю, в значній мірі делокалізованной по атомам кисню, вуглецю та азоту, і p *-орбіталь - розпушуються орбіталь, на якої в основному стані електрони відсутні. Два електронних переходу з найменшою енергією спостерігаються при порушенні електрона з n-орбіталі на p *-орбіталь (n В® p * перехід) і з p-орбіталі на p *-орбіталь (p В® p * перехід). n В® p * переходу в пептидах відповідає слабка смуга поглинання 210-220 нм, а p В® p * переходу набагато сильніша смуга з максимумом поблизу 190 нм (характерна для a-спіральної конформації).
КД різних типів вторинної структури білка можна оцінити за результатами вимірювання КД гомополіпептідов відомої конформації (наприклад, полі-L-лізину), після чого визначити внесок кожної зі структур в спектр КД досліджуваного білка. Однак, такий підхід має ряд великих недоліків. По-перше, ділянки впорядкованої вторинної структури модельних гомополіпептідов мають значно велику довжину, ніж довжина типових ділянок в глобулярних білках. По-друге, їх конформація може сильно відрізнятися від конформації, що спостерігається у елементів вторинної структури реальних білків. Крім цього, серед гомополіпептідов не можна знайти "стандартів" для b-вигинів. І, нарешті, хоча внесок у КД від взаємодій між хромофорами зменшується як квадрат відстані між ними, повинен існувати певний внесок від взаємодії між ділянками з різної вторинної структурою. Ці взаємодії не можна адекватно змоделювати, розглядаючи протяжні гомополімери. Тому на практиці спектри КД гомополіпептідов не використовуються. Замість цього в якості базисних беруть спектри КД білків, структура яких відома з даних рентгеноструктурного аналізу. Різні підходи до аналізу досліджуваного спектра КД на основі цього базисного набору визначають відмінності між методами, які будуть описані нижче.
1.2 Методи аналізу спектрів кругового дихроїзму білків
Метод "еталонних спектрів" [2,3]. М етод передбачення вторинної структури білків за їхніми спектрами КД засновані на припущенні про те, що спектри КД різних структурних форм, які складають білкову молекулу, дають адитивний внесок у спектр КД білка в цілому. Це можна записати в наступному вигляді:
(1.2.1) br/>
де - спектр КД білка (залежність еліптичності від довжини хвилі світла), - ідеалізований "Еталонний спектр" - спектр КД, відповідний i -ої структурної формі, що бере участь в утворенні вторинної структури білка, - частка цієї форми у вторинній структурі, причому
і. (1.2.2)
Еталонні спектри для всіх структурних форм можуть бути обчислені виходячи набору базисних спектрів КД (спектрів білків з відомою вторинною структурою - коефіцієнтами) за допомогою методу найменших квадратів і формули (1.2.1), застосованої до кожного базисного спектру. Після цього експериментальний спектр КД досліджуваного білка за допомогою того ж методу найменших квадратів може бути апроксимована за формулою (1.2.1) з використанням обчислених еталонних спектрів. При цьому внесок кожного з еталонних спектрів буде дорівнює частці відповідної йому структурній формі в загальній структурі білка Такий підхід до аналізу спектрів КД білків був вперше використаний в роботі [2]. Нижче буде більше докладно розглянута модифікація цього методу [3].
Приймаючи в розгляд в якості структурних класів a-спіраль (H), b-структуру (B), b-вигин (T) і "невпорядковану" форму (R), можемо написати:
. (1.2.3)
Підсумовуючи експериментальні дані, замість в рівняння (1.2.3) вводять величину , Що враховує залежність еталонного спектру, відповідного a-спіралі, від числа амінокислотних залишків, що утворюють її:
, (1.2.4)
де і - еталонні спектри для a-спіралі з n амінокислотних залишкі...
