/span >
Найбільш інтенсивно флюоресцирующий бенд для пари праймерів EGFP-3, 2 відповідає максимальній концентрації катіонів магнію в реакційній суміші і, як наслідок, великій кількості неспецифічних продуктів (В«шмерВ», див. рис ...). У той же час, порівнянні з цим бендом за інтенсивністю флюоресценції бенди доріжок 36 і 37, соответсвтующіе продуктам ПЛР з використанням пари праймерів EGFP-5, 6, характеризуються меншою кількістю неспецифічних продуктів. Умови реакції, в яких отримано продукт ПЛР, виявлений на доріжці 36, є найбільш придатними для виявлення EGFP в зразках. Цю пару праймерів надалі ми і використовували для подальшої оптимізації умов проведення ПЛР. Далі були підібрані оптимальні концертраціі праймерів EGFP-5 і EGFP-6 і дезоксинуклеозидтрифосфатов у зазначених вище умовах: температура відпалу 59,5 Вє С, а концентрація катіонів магнію в реакційній суміші 1,5 мМ. Позначення реакційних сумішей відповідно до умов проведення ПЛР наведені в п. 2.11.3 цієї роботи. На рис. 22 наведена фотографія прокрашенного бромистим етидієм агарозного гелю після проведення в ньому поділу продуктів ПЛР.
В
Рис. 22. Порівняння ефективності ампліфікації при різних концентраціях праймерів і dNTP. Позначення - див. п. 2.11.3. br/>
При максимальній концентрації (1 мМ) dNTP спостерігалася велика кількість утворюються неспецифічних продуктів при майже повній відсутності основного. Інтерес представляють умови В«8В» (найбільш інтенсивно флюоресцирующий бенд) і В«4В» (другий за інтенсивністю), тобто:
Таблиця 9. Підбір оптимальної концентрації праймерів і dNTP в РС. p align="justify"> ДорожкаС праймера , мкмс dNTP < span align = "justify">, мкМ В«8В» 0,5250 В«4В» 0,350
Умови В«4В» більш кращі зважаючи меншої кількості неспецифічних продуктів, а також меншої витрати реагентів.
Таким чином, оптимальні умови для виявлення EGFP методом ЗТ-ПЛР можна підсумувати в табл. 9. br/>
Таблиця 9. Оптимальні умови проведення ПЛР. p align="justify"> Прямий праймерEGFP-5Обратний праймерEGFP-6Концентрація праймерів в РС0, 3 мкМКонцентрація dNTP в РС50 мкМКонцентрація Mg 2 + в РС1 , 5 мМТемпература отжіга59, 5 Вє З
Висновки
1. Здійснено синтез кон'югатів олігодезоксінуклеотідов з піреном. Показано, що використовувані умови реакції призводять до отримання моно-перінільних кон'югатів з високим виходом.
2. Проведено порівняння двох методів виділення сумарної РНК з клітин. П...
