ди. br/>
Робота 14. Якісні реакції на компоненти нуклеїнових кислот
Реактиви. Нітрат срібла, 2%-ний аміачний розчин *; розчин аміаку, конц.; Аскорбінова кислота, 1%-ний розчин; молібдат амонію, розчин в азотній кислоті *; орціновий реактив *; діфеніламіновая реактив *. p align="justify"> Обладнання. Очні піпетки; піпетки місткістю 1 мл; штатив із пробірками; водяна баня. p align="justify"> Матеріал.
Гидролизат дезоксірібонуклеопротеіда (див. роботу 13, г).
Лікарські препарати нуклеотидної природи: фосфаден (аденозинмонофосфат), 2%-ний розчин в ампулах, і аденозинтрифосфат натрію, 1%-ний розчин в ампулах.
а. Проба на пуринові основи. Метод заснований на здатності пуринових основ з аміачним розчином нітрату срібла утворювати осад срібних солей пуринових підстав (аденіну, гуаніну), пофарбованих у світло-коричневий колір. p align="justify"> Хід визначення. У пробірку вносять 10 крапель гідролізату, поміщають в нього шматочок лакмусового паперу і доливають по краплях приблизно 10 крапель концентрованого розчину аміаку до лужної реакції по лакмусу. Додають 10 крапель аміачного розчину нітрату срібла. При стоянні утворюється осад з характерною забарвленням. p align="justify"> б. Діфеніламіновая проба на пентози. Принцип методу див. роботу 13, б. p align="justify"> Хід визначення. Для визначення беруть 5 крапель гідролізату і проробляють реакцію, як описано в роботі 13, б. p align="justify"> в. Молібденова проба на фосфорну кислоту. Принцип методу див. роботу 11. p align="justify"> Хід визначення. Беруть 10 крапель гідролізату і проробляють реакцію, як описано в роботі 11. p align="justify"> р. Якісні реакції на лікарські препарати нуклеотидної природи. Метод заснований на виявленні рибози в препаратах нуклеотидної природи за допомогою дифениламиновой реакції і проби з орціновим реактивом. Остання полягає в тому, що фурфурол, що утворюється з рибози при нагріванні в середовищі з соляною кислотою, дає з орціном забарвлене з'єднання зеленого кольору. p align="justify"> Хід визначення. У дві пробірки додають по 5 крапель відповідно розчину фосфадена і аденозинтрифосфату натрію. До них доливають по 10 крапель діфеніламіновая реактиву, нагрівають 10 хв на киплячій водяній бані. Відзначають результат реакції. p align="justify"> У дві інші пробірки вносять по 5 крапель тих же речовин і додають по 5 крапель орцінового реактиву. Нагрівають протягом 20 хв на киплячій водяній бані. Відзначають результат реакції. p align="justify"> Оформлення роботи. За результатами роботи зробити висновок про можливість використання реакції для виявлення компонентів нуклеїнових кислот і нуклеотидів та їх застосування в практиці. Дані оформити у вигляді таблиці. br/>
МатеріалВиявляемий компонентРеакціяРезультат реакції
Практичне значення роботи. Реакції на компоненти нуклеїнових кислот і нуклеотиди можуть застосовуватися для їх ідентифікації та кількісного аналізу в біохімічних дослідженнях, а в фармації - для контролю якості препаратів нуклеотидної і нуклеозидного природи. br/>
2. Кількісні методи визначення нуклеїнових кислот
Для кількісного визначення нуклеїнових кислот використовують методи, засновані на реєстрації їх світлопоглинання або на специфічних реакціях на окремі компоненти цих сполук. Нуклеїнові кислоти мають максимум поглинання світла при 260 нм, який обумовлений присутністю в них азотистих основ. Всі підстави полінуклеотідов володіють тим же максимумом абсорбції, за винятком цитозину, зона найбільшого поглинання якого знаходиться при 270 нм. Тому за інтенсивністю світлопоглинання азотистих основ нуклеотидів можна визначити зміст нуклеїнової кислоти в екстрактах з біологічного матеріалу або розчинах. Однак светопоглощение природного ДНК на 40-50% нижче, ніж складових її нуклеотидів. Цей так званий В«гіпохромний ефектВ» пов'язаний з двоспіральної структурою природного ДНК. Гіпохромний ефект характерний також і для РНК, що містять спіральні ділянки або петлі. p align="justify"> Враховуючи ці особливості нуклеїнових кислот, А.С.Спірін розробив метод вимірювання світлопоглинання гідралізат ДНК і РНК при двох довжинах хвиль - 270 і 290 нм, оскільки за цих умов на визначення концентрації нуклеїнових кислот практично не впливають відмінності в їх нуклеотидном складі.
Кількість нуклеїнових кислот у пробах можна виміряти, використовуючи реакції на пентози з дифеніламіном і орціном. Однак слід враховувати, що при кислотному гідролізі ДНК руйнується N-гликозидная зв'язок в пуріннуклеотідах, але не в пірімідіннуклеотідах. Тому тільки частина дезоксирибози стає реакционноспособной, причому величина її визначається нуклеотидним складом (відношенням пуринів до піримідиніл) ДНК. p align="justify"> Практичне значення р...
