обіт по кількісному визначенню нуклеїнових кислот. Кількісне визначення нуклеїнових кислот, що виділяються при біохімічних дослідженнях тканин і клітин, можна проводити прямий спектрофотометрією в ультрафіолетовій області або за допомогою специфічних реакцій на пентози: дифениламиновой - на дезоксирибозу, а з орціновой - на рибозу. Ці ж методи можна використовувати і при хроматографічному поділі пуринових і піримідинових нуклеозидів або нуклеотидів. Кількісні методи визначення нуклеїнових кислот застосовуються в експериментальної і клінічної біохімії, а також для кількісного аналізу лікарських засобів нуклеотидної або нуклеозидного природи в контрольно-аналітичних лабораторіях. br/>
Робота 15. Спектрофотометричний метод кількісного визначення нуклеїнових кислот по А.С. Спіріну
Реактиви. Хлорне кислота, 1 М розчин. p align="justify"> Обладнання. Штатив із пробірками і крапельницями; піпетки місткістю 2 мл; водяна баня; спектрофотометр. p align="justify"> Матеріал.
Гидролизат дезоксірібонуклеопротеіди тканини селезінки (отриманий в роботі 13, г).
РНК дріжджова, свіжоприготований розчин.
Метод заснований на вимірюванні світлопоглинання нуклеїнових кислот при 270 і 290 нм, інтенсивність якого пропорційна їх кількості в пробах.
Хід визначення. В одну пробірку вносять 1,0 мл гідролізату ДНК, в іншу - той же об'єм розчину РНК і доводять дистильованою водою до 1,5 мл. p align="justify"> Додають в кожну пробу по 1,5 мл розчину хлорної кислоти, закривають пробірки крапельницями і ставлять на гідроліз в киплячу водяну баню на 20 хв. Гідролізати охолоджують. Визначають екстинкцію вмісту кожної спроби на спектрофотометрі в кюветі з товщиною шару 1 см при 270 і 290 нм. p align="justify"> Розрахунок. Вміст ДНК розраховують за формулою
(Е270 - Е290) В· 10,1
х1 = ----------,
0,19
а РНК - за формулою
(Е270 - Е290) В· 10,5
х2 = ----------,
0,19
де х1 і х2 - концентрації ДНК і РНК, мг/л;
Е270 - екстинкція досліджуваного гідролізату при 270 нм;
Е290 - екстинкція досліджуваного гідролізату при 290 нм;
, 19 - питома екстинкція фосфору нуклеїнових кислот у концентрації 1 мг/л;
, 1 і 10,5 - коефіцієнти перерахунку вмісту фосфору на концентрацію нуклеїнових кислот виходячи з теоретичного вмісту фосфору в ДНК 9,9% і у РНК 9,5%.
Примітка. Попередньо перевіряють чистоту зразка. Для цього вимірюють екстинкцію досліджуваних розчинів ДНК і РНК при 260, 270 і 290 нм. Ставлення Е260/Е270 не повинно бути вище 1,2, а відношення Е270/Е290 не менш 2,0. Якщо ці умови не дотримуються, то проби містять домішки нуклеїнової природи. p align="justify"> Оформлення роботи. За результатами вимірювань відзначити чистоту зразків нуклеїнових кислот, розрахувати їх концентрацію у досліджуваних пробах. У висновку вказати можливості даного методу визначення вмісту нуклеїнових кислот. br/>
Робота 16. Фотоколориметричні методи кількісного визначення нуклеїнових кислот
Реактиви. Хлорне кислота, 1 М розчин; діфеніламіновая реактив *; орціновий реактив *. p align="justify"> Обладнання. Штатив із пробірками; піпетки місткістю 1 і 2 мл; водяна баня; ФЕК. p align="justify"> Матеріал.
Гидролизат ДНК тканини селезінки (див. роботу 13, г).
ДНК, стандартний свіжоприготований розчин концентрації 1 г/л.
РНК дріжджова, досвідчений розчин.
РНК, стандартний свіжоприготований розчин концентрації 1 г/л.
а. Визначення вмісту ДНК (за дише). Метод заснований на утворенні забарвленого комплексу дезоксирибози з дифеніламіном (див. роботу 13, б), інтенсивність якого пропорційна концентрації цієї пентози в гидролизатах ДНК. p align="justify"> Хід визначення. У пробірку наливають 0,5 мл стандартного розчину ДНК і рівний об'єм розчину хлорної кислоти. Ставлять пробірку в киплячу водяну баню на 10 хв. Потім охолоджують вміст. p align="justify"> У другу пробірку вносять 1 мл гідролізату ДНК тканини селезінки (дослідна проба), потім додають в обидві пробірки по 2 мл діфеніламіновая реактиву дише. Проби перемішують скляною паличкою і ставлять пробірки в киплячу водяну баню на 10 хв для розвитку забарвлення. Потім вміст пробірок охолоджують. p align="justify"> Дослідну і стандартні проби фотометрують проти контрольної проби на ФЕК при червоному світлофільтрі (довжина хвилі 595 нм) у кюв...
