НСС (патент РФ на винахід № 2224528, опубл. В БІ №6 від 27.02.2004). Він вимагає більш складної апаратури та реактивів.
Однак отримані новим і попереднім способом пептиди КНСС проявляють абсолютно однакову специфічну для них біологічну активність, виділені від ряду тварин (щурів, мишей, биків, свиней, котів, кролів, собак, жаб і курей), незалежно від методу виділення (BC Бахтінова, 1986; А.П. Бахтінов, І.Ю. Адамович, 1999; 2000; С.А. Лушкина, 20002; С.А. Лушкина, А.П. Бахтінов, 2002; С.А. Лушкина, О.Є. Ізотова, 2002). Тому ми обмежилися отриманням пептиду перший лабораторним способом - більш простим і доступним. [14]
Для цього заморожений спинний мозок тварин або людини звільняють від твердої і м'якої мозкових оболонок, гомогенезі-руют в дистильованої воді, що містить 0,05 М ЕДТА у співвідношенні 1: 5. Отриманий водний гомогенат тканини спинного мозку змішують з хлороформом у співвідношенні 1: 1 і зберігають в холодильній камері при температурі +5 - 8 ° С, протягом 1-го години періодично струшують суміш для повної денатурації високомолекулярних білків і кращої екстракції пептиду. Потім, за допомогою лабораторної центрифуги ЦДН - 2 при 8000 ± 10% об/хв протягом 30 хвилин відділяють хлороформенний фракцію, а денатурований білок і воду відкидають. Хлороформенний екстракт за допомогою вентилятора висушують в чашці Петрі при температурі 15-18 градусів. Сухий хлороформенний екстракт гомогенезируют дистилированной водою. Отриману суміш осаждаюь сульфатом амонію.
Всі проведені біохімічні дослідження свідетельсьву на користь виділення нами короткого пептиду, який на основі численних експериментів був ідентифікований як уротензін II (А.П. Бахтінов, 2005), названої спочатку нами вазото-Ніномія людським (Vasotoninum hominis ) - VH на підставі первинних його біологічних ефектів (К.А. Мещерская, А.П. Бахтінов, BC Бахтінова, 1977). [5]
Глава 2. Визначення основних біологічних показників короткого пептиду КНСС людини
. 1 Вивчення біологічної активності короткого пептиду КНСС людини
Спочатку біологічна активність виділеного гомогенного пептиду випробувана на кровоносних судинах брижі жаби. При цьому артеріальні судини значно підвищували свій тонус, зменшуючись в діаметрі в 2-3 рази. У зв'язку з цим препарат названий вазотоніном людським (Vasotoninum hominis) - VH.
. 2 Визначення одиниці активності короткого пептиду КНСС людини
Спочатку вона була визначена на перфузійному серце жаби. За одиницю активності прийнята така концентрація препарату в розчині, яка викликає збільшення частоти серцевих скорочень на 10 ± 2,7% від початкової. Певна методом Лоурі (Lowry, 1951), ця концентрація склала 0,5 мкг/мл протеїну (V-Н). Це так звана жаб'яча доза (ЛД). При визначенні властивостей препарату в гострому досвіді на кроликах масою 2,8-3,0 кг за одиницю активності приймалося кількість препарату, що викликало у них підвищення систольное артеріального тиску на 10 ± 1,5% від вихідного, що становило 4 мкг/кг протеїну за Лоурі.
Дослідження впливу одиниці активності короткого пептиду КНСС людини на органи-мішені статевих гормонів
За одиницю активності приймалося кількість препарату, що викликало зниження маси матки статевозрілих щурів у фазі межтечкі в 1,5 рази в порівнянні з контролем після введення певного титру розчину даного препарату. Експеримент тривав 6 днів. Було доведено, що доза, що викликає таку дію на матку щурів, відповідає 25 мкг/кг протеїну, що визначається методом Лоурі.
При проведенні подальших досліджень на ссавців за терапевтичну (робочу) дозу VH приймалася маса короткого пептиду КНСС людини, рівна 25 мкг/кг. Ця експериментально обгрунтована доза (25 мкг/кг) постійно застосовувалася в роботі з гомойотернимі тваринами.
антіестрогеном і антиандрогенний ефекти VH були перевірені нами на щурах обох статей (К.А. Мещерская, А.П. Бахтінов, BC Бахтінова, 1977), коли враховувалося зниження маси матки у самок і зменшення маси простати у самців щурів і контрацептивний ефект, що спостерігається у особин обох статей після відповідного експерименту, а також вазоактивний ефект; який і послужив причиною назви даного пептиду вазотоніном людським (Vasotoninum hominis) - VH.
Гостра та хронічна токсичність активного пептиду, його вплив на гемодинамічні показники в гострому і хронічному дослідах, вплив на електрокардіограму, вазотоніческого ефект в досвіді по методу Кравкова-Соловейчик на ізольованих вухах кролика, дослідження скорочувальної здатності вен, вплив VH на масу органів зростаючих пацюків, більш точне визначення його контрацептивного ефекту, спостереження за розвитком і розмноженням у щурів 2 і 3 поколінь після контрацептивного ефекту...
