далі Суворов дотріманні низьких температур (4 ° C) середовища при пріготуванні клітін.
Електропорація - Інший способ создания отворів в клітінах, Раптовий Шокуюча їх ЕЛЕКТРИЧНА Струмило з напругою 100-200 В/мм. Плазмідна ДНК может проникнуті до Клітини через ЦІ відчини. Природні Механізми Відновлення мембрану Згідно латають ЦІ відчини. Особлівість цього методу Полягає в тому, что середовище, в якому знаходяться Клітини, повінні буті знесолені для Запобігання короткого замикання.
Плазміді містять послідовності, что дозволяють Їм реплікуватіся у клітіні Незалежності від хромосоми.
У Експеримент Використовують плазміді, Які містять ген стійкості до антібіотіків и Бактеріальні штами, что НЕ мают стійкості до цього антібіотіку (так кличуть входити селекція).
Тому, только трансформовані бактерії могут Вижити на селективного середовіщі з ЦІМ антібіотіком.
например, плазміда, что містіть ген, Який кодує білок Я-лактамазу (тобто містіть bla-ген), Робить бактерій стійкімі до ампіціліну. Бактерії потім вірощуються на середовіщі з ампіціліном, вбіваючі бактерій, Які НЕ прийнять bla-ген.
Інший способ детекції клітін, что пройшли трансформіцію, - скрінінг, тобто использование генів, что роблять трансформовані бактерії візуально відміннімі.
например, для цього вікорістовується галактозидазної тест або експресія флюоресцентних білків, таких як GFP [1].
. 1.2 Дріжджі та Інші гриби
известно кілька методів трансформації дріжджів:
Високоефективний трансформація (High Efficiency Transformation) согласно з протоколом, запропонованім Gietz та Woods.
Дво-гібрідній протокол (Two-hybrid System Protocol): Дво-гібридна система Залучає использование двох різніх плазмід в єдіній клітіні дріжджів. Одна плазміда містіть ген або послідовність ДНК, что повінні буті внесені до клітін, а Інша плазміда містіть бібліотеку генома або кДНК (cDNA).
Швидкий протокол трансформації (Rapid Transformation Protocol) - див. посилання на агентство статью Gietz/Wood вищє.
Протокол замерзло дріжджів (Frozen Yeast Protocol) дозволяє Приготування замерзлі клітін дріжджів, компетентних для трансформації после розморожування.
ГЕНЕТИЧНОГО гармата (Gene Gun Transformation) - бомбардування клітін золотими або вольфрамові частинками покриттям ДНК.
Протопластна трансформація (Protoplast Transformation) - грибні спори могут буті перетворені на протопластах, Який могут прійніматі ДНК Із Розчин и трансформуватіся [1].
1.1.3 Рослини
Рис. 1 Росліна (S. chacoense) трансформовані вікорістовуючі Agrobacterium tumefaciens. Трансформовані Клітини формують калуса на листових експланті
Доступні Механізми перенесеного ДНК до рослинних організмів включаються:
Трансформація помощью Agrobacterium tumifaciens. Agrobacterium tumifaciens - це природня бактерія, яка паразітує на Рослін и містіть спеціальну Ti - плазміду, в склад якої входити Т-ДНК, что здатно пронікаті в клітіну рослини господаря и вбудовуватісь в геном, а такоже vir-гени, відповідальні за процес переносу ДНК. Т-ДНК містіть гени синтезу рідкіх амінокіслот и вуглеводів (опінів), Якими живитися бактерів, а такоже гени фітогормонів, что спричиняють пухліноподібній ріст рослинних тканин. Рецепторів на поверхні бактерії спріймають продукти Розкладая рослинної клітінної стінкі, в результате чего актівуються vir-гени, продукти якіх спріяють процесса перенесенню Т-ДНК в Рослін клітіну. Сама бактерія в Рослін клітіну при цьом НЕ потрапляє. Для генетичної трансформації рослинної Клітини Використовують бінарну веторну систему, яка складається з плазміді, что містіть Т-ДНК, де гени синтезу опінів и пухліноутворюючіх фітогормонів замінені на цільовій ген, Який має вбудуватісь и хелперної плазміді, что містіть vir-гени, что обслуговують процес переносу ДНК. Рослинна тканина (найчастіше, листя) нарізається на маленькі шматки, (біля 10x10 мм) i поміщається на 10 хвилин в середовище зAgrobacterium, Який містіть плазміду для перенесеного. Здатність рослин утворюваті на місці пораненному мерістематічну тканинний, яка при питань комерційної торгівлі условиях (фітогормональному складі середовища in vitro) здатно до регенерації и утворює вегетатівні Пагоні з окремим трансформованості клітін. Далі рослини вірощуються на селективного середовіщі.
Деякі види рослин могут буті трансформовані методом in planta путем вакуумного прісмоктування агробактерії до рослинної тканини. Це может буті як стабільна трансформація путем зараженням квіток (у такому разі трансформується ембріональна тк...
