а поліетіленіміну, фракціонування сірчанокіслім амонієм, гідрофобну хроматографію на фенілсілохроме С - 80, рН-фракціонування лізата, его концентрування и діафільтрація, іонообмінну хроматографію на целюлозі DE - 52, елюювання в градієнті рН, іонообмінну хроматографію отриманий елюента на целюлозі СМ- 52, концентрування пропусканням через касету фільтрів и гель-фільтрацію на сефадексе G - 100 (SU 1640996). Недоліком цього способу крім складної багатостадійної ферментації є багатостадійність при отріманні кінцевого продукту.
Відомій такоже способ Отримання інтерферону, что Включає в собі культівування штам E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульйоні в колбах в термостатированной шейкері, центрифугування біомасі, ее промівання буферних Розчин і обробка ультразвуком для руйнування клітін. Отриманий лізат центрифугують, промівають 3М Розчин сечовіні в буфері, розчіняють в розчіні гуанідін хлориду в буфері, обробляють ультразвуком, центрифугують, проводять окіслювальній сульфітоліз, діаліз проти 8 М сечовіні, ренатурацією и залишкових двостадійну хроматографію на СМ - 52 целюлозі и сефадексі G - 50 ( RU 2054041).
Недолікамі цього способу є его відносно невісока Продуктивність основних етапів процесса віділення та очищення. Особливо це відносіться до ультразвукової ОБРОБКИ продукту, діалізу и окіслювальному сульфітолізу, что виробляти до нестабільності виходим інтерферону, а такоже до неможлівості использование цього методу для промислового виробництва інтерферону. Як найбільш близьким аналога (прототипу) может буті зазначену способ Отримання лейкоцитарного інтерферону людини, что Полягає в культівуванні рекомбінантного штам E.coli, заморожування отріманої біомасі при температурі НЕ вищє - 70 ° С, розморожування, руйнуванні клітін мікроорганізму лізоцімом, відаленні ДНК и РНК введенням в лізат ДНК-ази та очищених віділеної нерозчінної форми інтерферону відміванням буферних Розчин з детергентами, розчіненні облогу інтерферону в розчіні гуанидин гідрохлоріду, ренатурації и одностадійної очищених іонообмінної хроматографією. Як продуцент Використовують штам E.coli SS5, отриманий помощью рекомбінантної плазміді pSS5, яка містіть трьох промотора: Plac, Pt7 и Ptrp, и ген альфа-інтерферону з введенням нуклеотидними замінамі.
Експресія інтерферону штам E.coli SS5, что містіть Цю плазміду, контролюється трьома промоторами: Plac, Pt7 и Ptrp. Рівень експресії інтерферону складає около 800 мг на 1 л клітінної суспензії. Недоліком способу є низька технологічність использование ферментативного руйнування клітін, ДНК и РНК мікроорганізму и одностадійна хроматографічна очищення інтерферону. Це обумовлює нестабільність процесса віділення інтерферону, виробляти до зниженя его якості та обмежує можлівість использование Наведеної схеми для промислового виробництва інтерферону.
Недолікамі даної плазміді и штам на ее Основі є использование в плазміді сильного нерегульованого промотора фага Т7 в штамі Є. coli BL21 (DE3), в якому ген Т7 РНК полімерази находится под промотором lac оперона и Який всегда Протя raquo ;. Отже, в клітці безперервно відбувається синтез інтерферону, что виробляти до дісоціації плазміді и зниженя жіттєздатності клітін штам, и в результате - зниженя виходим інтерферону. Для Отримання великих кількостей ІФН Використовують шестіденні одношарові культури клітін КУРЯЧОГО ембріона або культівовані лейкоцити крови людини, заражені Певнев видом вірусу. Іншімі словами, для Отримання ІФН створюють Певнев систему вірус-клітина.
З Клітки людини ізольованій ген, відповідальний за Біосинтез ІФН. Екзогенній людський ІФН отримуються, вікорістовуючі технологію рекомбінантніх ДНК. Процедура віділення кДНК ІФН-ів Полягає в Наступний:
1) З лейкоцітів людини віділяють мРНК, фракціонують ее за розмірамі, проводять зворотнього транскріпцію, вбудовують в сайт модіфікованої плазміді.
2) отриманий продуктом трансформують Є. соli; утворена клони, Які підрозділяють на групи, потім ідентіфікують.
) шкірних групу клонів гібрідізують з ІФН - мРНК.
4) З Утворення гібридів, Які містять кДНК и хРНК, віділяють мРНК, проводять ее трансляцію в сістемі синтезу Білка [4].
5) визначаються інтерферону протівірусну Активність кожної суміші, отріманої в результате трансляції. Групи, что проявили інтерферону Активність, містять клон з кДНК, гібрідізуваті з ІФН - мРНК; повторно ідентіфікують клон, что містіть повнорозмірну ІФН - кДНК людини.
Малюнок 1. Схема виробництва інтерферону.
3. Основне обладнання для виробництва інтерферону
. 1 Реактор-змішувач
Основним технологічним обладнанням являється реактор-змішувач, в якому безпосередно и від...
