'язки між тими чотирма підставами, які утворюють липкі кінці, недостатньо міцні, щоб утримати два об'єдналися фрагмента ДНК. Необхідний якийсь інструмент для усунення розриву в сахарофосфатнимі остові молекули. Таким інструментом є ДНК-лігаза бактеріофага Т4. Цей фермент каталізує утворення фосфодіефірних зв'язків між кінцями полінуклеотидних ланцюгів, які вже утримуються разом завдяки спаровування липких кінців. Крім того, ДНК-лігаза Т4 «зшиває» тупі кінці, які зближуються один з одним після того, як об'єднуються фрагменти зв'язуються з ферментом.
друге , об'єднання різних молекул ДНК саме по собі даремно, якщо новоутворені комбінації (рекомбінантні ДНК) не братимуть реплицироваться в клітині-хазяїні. Таким чином, якщо одна масть рекомбінантної молекули ДНК несе потрібний ген, який передбачається клонувати, то інша повинна містити інформацію, необхідну для реплікації в клітині рекомбінантної ДНК. Щоб вирішити цю проблему, використовують клонуючі вектори.
третє , при рестрикції ДНК утворюється суміш різноманітних фрагментів, і після їх легування з векторною ДНК утворюється безліч різних комбінацій. Необхідно вміти розпізнавати тереціпіентние клітини, які містять ДНК з потрібною нуклеотидной послідовністю.
2. Вектор
Вектор (у генетиці) - молекула нуклеїнової кислоти, найчастіше ДНК, використовувана в генетичній інженерії для передачі генетичного матеріалу іншій клітці.
Існуючі вектори:
плазміди
вектор на основі бактеріофага
вектори на основі вірусів еукаріотичних організмів
.1 Плазміди
Багато властивості бактерій, цікаві з точки зору біотехнології, кодуються плазмідами. Плазміди-це кільцеві молекули ДНК, які стабільно передаються потомству бактеріальних клітин незалежно від хромосомної ДНК. У генетичній інженерії плазміди використовуються для клонування потрібних генів.
Плазміди розрізняються за молекулярною масою, так найдрібніші плазміди кодують один-два білка середнього розміру, тоді як більші - 300 або більше білків. Великі плазміди можуть кодувати безліч ферментів, необхідних для роботи цілої послідовності біохімічних реакцій, наприклад для перетворення толуолу в катехол.
В бактеріальних клітинах плазміди існують у вигляді кільцевих дволанцюжкових ДНК, які, крім того, знаходяться в сверхспіральном стані. Деякі з плазмід можуть існувати лише в клітинах одного або двох близьких видів. До числа плазмід з широким колом господарів відносяться RP4, RK2 і подібні з ними плазміди, що несуть маркер стійкості до лікарських препаратів (R-плазміди), які належать Р-групі несумісності (члени однієї і тієї ж групи несумісності не можуть співіснувати в бактеріальної клітці) . Ці плазміди були перенесені в багато види грамнегативних бактерій; створюється враження, що їх господарями можуть бути всі штами грамнегативних бактерій.
Таким чином, R-плазміди, які відносяться до групи Р, особливо підходять для генетичних експериментів з грамнегативними бактеріями, використовуваними в промисловості. За допомогою цих плазмід ми можемо здійснювати перенесення хромосомних генів між неспорідненими видами. Невеликі за розміром похідні плазмідRP4 і RK2 викорис...
