що найбільша зустрічальність TUNEL-ядер кардіоміоцитів характерна для I і II клінічних груп (0,65 і 0,58 відповідно), тобто була встановлена ??істотна значущість апоптозу кардіоміоцитів на ранніх етапах ремоделювання лівого шлуночка. Таким чином, максимальна ефективність лікувальних заходів, спрямованих на терапію ішемічного ремоделювання міокарда, може спостерігатися лише на ранніх стадіях захворювання. На більш пізніх стадіях терапія, спрямована на управління апоптозом, може виявитися малоефективною [14].
У роботі A. Abbate і співавторів було показано, що у пацієнтів померлих (за період? 10 днів) після гострого інфаркту міокарда постинфарктное ремоделювання міокарда лівого шлуночка і розвиток серцевої недостатності було пов'язано з апоптозом кардіоміоцитів, причому постинфарктное розвиток серцевої недостатності корелювало з зрослим приблизно в 4 рази апоптозом (з 6, 4% до 26, 2%) в області інфаркту. Крім того апоптоз кардіоміоцитів як в області інфаркту, так і в неуражені ділянках посилював ремоделирование міокарда лівого шлуночка. Для визначення апоптозу кардіоміоцитів використовували метод TUNEL і иммуногистохимический (антитіла до каспазой - 3) [16].
Методи виявлення апоптозу кардіоміоцитів
Спочатку ідентифікація апоптичних клітин базувалася тільки на морфологічному критерії [17]. Наявність артефактів і суб'єктивна інтерпретація ознак сниж?? ло достовірність визначення апоптозу в кілька разів, тому були потрібні додаткові методи.
В даний час існує велика кількість методів виявлення апоптозу кардіоміоцитів: електронна мікроскопія, метод TUNEL, забарвлення Annexin V, імунодетекції ефекторів апоптозу, електрофорез ДНК, різні флуоресцентні ядерні барвники. Використання барвників дозволяє зареєструвати морфологічні ознаки, такі як конденсація і деградація хроматину. Виявлення формуються розривів ДНК і її деградації здійснюється методом електрофорезу (виявлення сходи ДНК). Наявність олігонуклеотидів, вбудованих в ДНК через її вільні кінці, що формуються в ділянках розривів, визначається за допомогою таких морфологічних методів як TUNEL (TdT-mediated dUTR-biotin nick end-labeling) або ISEL (in situ end-labeling).
Класифікацію методів виявлення апоптозу кардіоміоцитів можна проводити і за часом появи апоптотичних змін в клітці, так Annexin V метод і імунодетекції можна віднести до методів виявлення ранніх ознак апоптозу (поява фосфатидилсерина на поверхні клітини, активація каспаз), а метод TUNEL, електрофорез ДНК, використання флуоресцентних ядерних барвників, електронна мікроскопія - до методів виявлення пізніших ознак апоптозу (розриви ДНК та інші ушкодження).
Одним з найбільш поширених методів детекції апоптозу кардіоміоцитів є TUNEL метод, який дозволяє виявляти апоптотичні клітини з фрагментацією ДНК, у яких ще відсутні або слабо виражені морфологічні зміни, характерні для апоптозу. Цей метод заснований на застосуванні міченого біотином урідінтріфосфата, який зв'язується з вільними З. _ОН кінцевими групами фрагментів ДНК. Даний метод має високу надійність тільки у випадку клітин і тканин з низьким проліферативним індексом, тому відносно добре підходить для кардіоміоцитів. Необхідно враховувати, що мітка буде виявлятися також на ДНК в процесі її репарації, і в некротичних тканинах [35]. Під час апоптозу під дією ендонуклеаз відбуваються численні розриви ниток ДНК, в результаті чого утворюється безліч її 3 _ОН кінців. Їхня присутність у клітинах можна визначити за допомогою модифікованих нуклеотидів (наприклад, біотін_dUTP) в реакції мічення однониткових розривів, катализируемой ДНК_полімеразой або термінальній дезоксінуклеотідтрансферазой (ТДТ). Мічені 3 _ОН кінці молекули ДНК в індивідуальних клітках потім виявляються за допомогою авідіна, кон'югованого з флуоресцентним барвником. Цей метод використовували у своїй роботі Л.С. Погодіна і співавтори при індукції апоптозу кардіоміоцитів ізопротеренолом [6], А.П. Друже і співавтори при дослідженні ролі апоптозу кардіоміоцитів в механізмах ішемічного ремоделювання міокарда [14] та багато інших [7,9,11,13]. Т.Е. Володимирська і співавтори при вивченні ролі апоптозу кардіоміоцитів у розвитку ішемічної хвороби серця використовували модифікований TUNEL метод, в якому візуалізація мічених моно - і олігонуклеосомние фрагментів ядерної ДНК здійснювалася шляхом приєднання вторинних антитіл, кон'югованих з пероксидазою, і освіти іммунокомплексов з субстратом (спеціальний реагент Cytonin TM дозволяв ідентифікувати апоптотичні кардіоміоцити) [13].
В даний час широко поширений цітофлуоріметріческій метод виявлення апоптотичних клітин, однак його застосування обмежене при використанні зрізів тканини після хімічної фіксації. (Проточна цитофлуориметрії - це процес, в якому вимірюються фізичні та хімічні характеристики одиничних клітин або інших біологіч...
