них і небіологічних частинок приблизно однакового розміру, що проходять через оптичну систему в потоці рідини). Одним з основних методів детекції процесів апоптозу за допомогою проточної цитофлуориметрії є використання системи ANNEXIN V - FITC, заснованої на спільному використанні аннексіна V, аффинного до фосфатидилсерину і иодида пропідія, який проникає в клітини, взаємодіючи з ДНК. Фосфатидилсерин - фосфолипид, який в процесі апоптозу локалізується на клітинній поверхні і формує один з специфічних сигналів для розпізнавання апоптотической клітини. Різне насичення клітинами двома барвниками дозволяє визначити живі, некротичні і апоптотичні клітини. Цей метод використовували Dumont EA і співавтори для ідентифікації апоптозу кардіоміоцитів, викликаного ішемією/реперфузією [20].
Електрофорез ДНК для виявлення апоптозу кардіоміоцитів використовували у своїй роботі В.Б.Сапрунова і співавтори (індукція апоптозу в умовах аноксії) [3], H. Fliss і співавтори на моделях ішемії та ішемії з наступною реперфузією [ 10].
Иммуногистохимический метод, а саме антитіла до фосфорильованій формі гистона? -H2AX, використовували у своїй роботі Михайлов В.М. і співавтори для реєстрації подвійних розривів ДНК (після динамічного стресу у нормальних мишей і мишей mdx). Ідентифікацію апоптозу кардіоміоцитів за допомогою антитіл до каспазой - 3 проводили M. Malmberg і співавтори (розвиток апоптозу в умовах ішемії за допомогою аортального затиску) [11], A. Abbate і співавтори (апоптоз кардіоміоцитів в умовах хронічної серцевої недостатності) [16].
Для визначення конденсації і фрагментації хроматину, яка відбувається при апоптозу, використовують флуоресцентні барвники: Hoechst, dUTP (deoxyuridine triphosphate), PI (propidium iodide). Наприклад, dUTP і PI застосовували G.Olivetti і співавтори при вивченні ролі апоптозу кардіоміоцитів у розвитку ішемічної кардіоміопатії у людини. [17]
Для досягнення найкращого результату при ідентифікації апоптозу кардіоміоцитів використовують відразу декілька методів: TUNEL метод та електронна мікроскопія [6], електрофорез ДНК та електронна мікроскопія [3], TUNEL метод і імуногістохімія [11].
При інтерпретації отриманих результатів слід пам'ятати, що апоптоз є оборотним процесом (до активації каспаз 3, 6, 7), а значить не всі клітини, мічені маркерами ранніх стадій апоптозу, обов'язково загинуть. Приміром, не всі кардіоміоцити, аннексін-позитивні і при цьому не забарвлювані пропідій йодидом, а також клітини, забарвлювані антитілами на Fas, обов'язково завершать програму апоптозу і загинуть [35].
Морфологічні ознаки апоптозу кардіоміоцитів
Як неодноразово показано різними групами дослідників, апоптоз кардіоміоцитів (як і інших клітин) протікає в дві стадії: початкову (повільну) і фінальну (швидку). На початковій стадії апоптозу клітина втрачає частину цитоплазми, відбувається пошкодження ДНК, що проявляється в конденсації хроматину і появі інвагінацій ядерної мембрани. Фінальна (деструктивна) стадія характеризується пошкодженням ядерної оболонки, клітинних мембран, руйнуванням ядерного вмісту і цитоплазматичних органел [4].
Морфологічні ознаки ранньої стадії апоптозу кардіоміоцитів при використанні відповідних маркерів видні на електронномікроскопіческом рівні, тоді як більш пізні апоптотичні зміни в структурі кардіоміоцитів можна спостерігати за допомогою як електронної, так і світлової мікроскопії (конденсація хроматину, поява апоптичних тел ) [21].
Ультраструктурні ознаки апоптозу кардіоміоцитів включають:
? Зменшення об'єму апоптотической клітки;
? Інвагінації ядерної оболонки;
Ультраструктура кардиомиоцита лівого шлуночка щури після впливу ИЗП (Погодіна і співавтори, 2006)
? Конденсація хроматину;
? Зміна структури і положення мітохондрій;
Переміщення мітохондрій в кардіоміоциті лівого шлуночка щури після впливу ИЗП (Погодіна і співавтори, 2006)
? Фрагментація ядра і цитоплазми з утворенням дрібних, оточених мембраною апоптотичних тіл;
апоптотического тіло, оточене фрагментованою мембраною (E.Arbustini і співавтори, 2008)
? Фагоцитоз макрофагами апоптотических тел
Поглинання макрофагом апоптотических тіл (E.Arbustini і співавтори, 2008)
У роботі Михайлова В.М. і співавторів були описані ультраструктурні особливості ядер початковій і деструктивної стадій апоптозу кардіоміоцитів мишей mdx. За ступенем вираженості інвагінацій ядерної мембрани і розподілу конденсованого хроматину ядр...
