мікроорганізмів на середовищі з З 2 -з'єднаннями, синтез клітинних компонентів і конверсія ЖК у вуглеводи. Крім того, зовсім недавно було відкрито, що робота ГЦ є необхідною умовою для віруллентності патогенів тварин, людини і рослин.
У вищих рослин роль глиоксилатного циклу зводиться, як правило до утилізації запасних жирів при проростанні насіння і спор. При проростанні насіння запасні жири, які є водонерастворімимі, перетворюються на вуглеводи, які добре розчиняються у воді, що забезпечує можливість далекого транспорту запасних речовин до місць утилізації, де вони беруть участь у процесах біосинтезу клітинних компонентів. Глиоксилатного циклу належить ключова роль при глюконеогенезі, оскільки саме наявність ферментів глиоксилатного циклу - ізоцітратліази і малатсінтази - забезпечує протікання цього процесу.
Прістствіе гліксілатного циклу було доведено для проростаючих суперечка папоротей Dryopteris filixmas, Polypodium vulgare і хвоща Equisetum arvense [14]. У голонасінних також встановлено наявність глиоксилатного циклу в проростаючих насінні ялиці, деяких видів сосни [13], а також у гінго. При чому активність глиоксилатного циклу корелює зі ступенем маслянистості насіння. ІЦЛ зустрічається також в дозріваючих плодах банана [31], в зрілих плодах авокадо [7], в зеленого листя ряду рослин. В даний час список покритонасінних, в яких виявлений гліоксилатний цикл, досить великий.
Довгий час вважалося, що ферменти глиоксилатного циклу з'являються тільки при проростанні олійного насіння. Але потім було показано, що незначна активність цих ферментів може спостерігатися і в сухих насінні, при чому показано, що гліоксісомальние ферменти синтезуються вже на стадії дозрівання насіння, будучи присутнім в мікротільця.
Що стосується вищих рослин, то питання про можливість індукованого синтезу ІЦЛ майже не вивчений.
1.4 Характеристика структури гена і білка ІЦЛ
Охарактерізовал ген ІЦЛ метилотрофних жрожжей Pichia pastoris. Продукт ген ІЦЛ знайдений скринінгом геномної бібліотеки P. pastoris. Використовуючи пару вироджених праймерів, даний ген був клонований методом ПЛР. Розмножений ген ІЦЛ містив відкриту рамку зчитування розміром 1563 н. п. секвенований білок складався з 551 амінокислоти [22].
Молекулярна маса субодиниці склала 60,6 кДа з високим ступенем гомології ІЦЛ з інших джерел. Амінокислотна гомологія склала 64% з ІЦЛ Saccharomyces cerevisiae. Ген ІЦЛ, розміром 1458 н.п. був ізольований з метилотрофних дріжджів Hansenula polimorpha. Дана послідовність нуклеотидів кодує 468 амінокислот білка з молекулярною масою субодиниці 54. 9 кДа.
Ген кодує ізоцітратліазу у псіхрофітной бактерії Colwellia maris був клонований і секвенирован. Довжина гена icl склала +1584 пар основ, а довжина первинної амінокислотної послідовності білка - 528 амінокислотних залишків. Молекулярна маса білка склала 58 кДа [28].
Іншими дослідниками була розшифрована кДНК з Strongyloides stercoralis. Сиквенс нуклеотидної послідовності кДНК показав, що вона кодує ІЦЛ. Концептуально отримана амінокислотна послідовність з відкритою рамкою зчитування кодує білок розміром 450 амінокіслтних залишків з молекулярною масою субодиниці 50кДа.
Показано, що в м'язових клітинах, а також клітинах кішечіка C. elegans в надлишку міститься білок з молекулярною масою 106 кДа [21], який володіє ІЦЛ і МС каталітичними активностями. Даний білок названий біфункціонального білком глиоксилатного циклу. Його кДНК складається з 3274н. п. N-кінцевий домен білка складається з 443 амінокислотних остататков і має значний ступінь гомології з ІЦЛ грибів, бактерій і рослин. Ізоцітратліаза з кукурудзи Zea mays L. - тетрамерний білок, що складається з ідентичних субодиниць з молекулярною масою 64 kDa кожна [30].
Також показано, що ізоцітратліаза M. tuberculosis має гомотетрамерное будову. Кожна субодиниця складається з 14? - Спіралей і 14? - Структур. Всі субодиниці стійко пов'язані взаємодією спіралей. Вісім? - Спіралей і вісім? - Структур, що становить найбільший домен і основу структури, формує? /? - Барель. Активний центр ІЦЛ типово для подібних структур формується C-кінцевими залишками? - Структур. Плоска молекула гліоксілата в активному центрі координаційно зв'язується з іоном Mg 2+, а також утворює водневі зв'язки з амінокислотними залишками Ser 91, Gly 92, Trp 93, Arg 228. Молекула сукцината з іншою частиною активного центру ферменту і формує водневі зв'язки з Asn 92, Glu 295, Arg 228, Gly 192, (перша карбоксильная група) і Thr 347, Asn 313, Ser 315, Ser 317, His 193, (друга карбоксильная група).
Глава 2. Експериментальна частина
. 1 Цілі і завдання
