вектори на основі як сигма-так і тета-репліконов.
1.2. Вектори експресії
У простому випадку для експресії досить клонувати потрібний ген разом з його промотором і сайтом зв'язування з рибосомою (ribosome binding site, RBS) у природне плазміду, здатну реплицироваться в хазяїні, в якому потрібно проекспрессіровать даний ген. Так, наприклад, в B. subtilis був проекспрессіровать ген термостабільної арабінази термофільною бактерії Bacillus thermodenitrificans . Для цього фрагмент, що містить даний ген (з передбачуваним промотором і RBS) був клонований в природне плазміду pUB110 (Takao et al., 2002).
Іноді зручно експресувати ген з не свого промотора, що дозволяє вести експресію на більш високому рівні, або контролювати її. Так, ген термоактивній пуллуланази гіпертермофільной анаеробної архебактерии Desulfurococcus mucosus ( apuA ) був успішно експресований в B. subtilis (Duffner et al., 2000). Експресія гена йшла під контролем промотора P amy M (рис. 2).
В
Рис. 2. Структура вектора pJA803 для клонування пуллуланази. RepB - область реплікації pUB110; Cm - ген стійкості до хлорамфеніколу; apuA - ген пуллуланази; P amyM - промотор гена мальтогенной a-амілази з B. stearothermophilus .
В обох вищеописаних випадках спостерігався відносно невисокий рівень експресії, однак, білки секретироваться в середу в кількості, що дозволяє їх виділення в чистому вигляді і подальше вивчення властивостей.
У випадку, коли необхідно регулювати рівень експресії або експресувати білок в дуже великих кількостях, використовують більш складні системи експресії.
B. subtilis є дуже зручним організмом для проведення в ньому експресії різних продуктів, тому що ця бактерія володіє цілим рядом корисних властивостей: непатогенних, наявність механізмів секреції, добре вивчені генетика та умови необхідні для експресії генів, простота маніпуляцій з використанням стандартних протоколів. Для підвищення рівня продукції гетерологичних білків в клітинах B. subtilis використовують штами, дефектні по протеазам. Крім того, можна застосувати більш ефективні регуляторні елементи транскрипції і трансляції. Так, наприклад, була створена касета Veg (Lam et al., 1998) містить сильні регуляторні елементи, які підходять для ефективної експресії і секреції гетерологічного білка. До складу касети увійшли: промотор B. subtilis veg I; lac оператор E. ; coli ; сайт зв'язування з рибосомою (RBS) B. subtilis ; лідерних послідовність стафілококового білка А (SPA); термінатор транскрипції глюконатового оперона B. subtilis ( gnt ); полілінкерамі (multiple cloning site, MCS), що містить сайти рестрикції Xba I, Sma I; стоп кодони дл...
