я всіх рамок зчитування; фланкирующие EcoR I і Kpn I сайти (рис.3). br/>В
Рис. 3. Схематичне зображення регуляторних елементів у касеті Veg. p> Довжина касети 356 п.н. RBS - сайт зв'язування рибосоми; SPA - стафілококовий білок А; MCS - полілінкерамі. Подробиці у тексті. br/>
Касета Veg була вставлена ​​в полілінкерамі човникового вектора pM2 (рис. 4) з утворенням pM2Veg - вектора для експресії і секреції білка в B. subtilis .
Для перевірки ефективності функціонування вектора pM2Veg, в якості гена-репортера застосували ген ендоглюконази (ген cenA з Cellulomonas fimi ). Була здійснена вставка даного гена у сайт Xba I вектора pM2Veg. За допомогою даної системи була досягнута продукція ендоглюконази на рівні більш ніж в чотири рази перевищує найвищий з рівнів продукції досягнутих з допомогою інших систем експресії. Експресія і секреція білка залишалася на стабільному рівні, і не чинила ні яких несприятливих ефектів на стабільність вектора і життєздатність клітин.
В
Рис. 4. Схематичне зображення векторів pM2 і pM2Veg.
ori pMB1 і ori pUB110 - Реплікаційний регіони плазмід pMB1 і pUB110, відповідно;,, - гени стійкості до ампіциліну, Блеоміцин і неоміцину, відповідно.
За допомогою pM2Veg в B. subtilis також експресувати ген hEGF - ген фактора росту епідермісу людини. Реєстрований рівень hEGF був цілком порівнянний з рівнем експресії даного гена при використанні інших систем. Ці дані вказують на те, що вектор pM2Veg може успішно використовуватися для експресії в B. subtilis різноманітних гетерологичних білків. p> Ще одна ефективна система експресії розроблена на основі ксілозний оперона (Bhavsar et al., 2001).
Створена система експресії складається з наступних елементів (Ріс.5b):
1) промотор P xylA , під контролем якого йде експресія клонованого гена;
2) 5 Вў - кінцева ділянка гена xylA (ген ізомерази ксилози), що містить оптимізований CRE (catabolite-responsive element) - цис-діючий елемент, репресує транскрипцію xyl оперона;
3) оператор xylO , з яким у відсутність індуктора (ксилози) зв'язується репрессор XylR;
4) ген xylR , що кодує репрессор XylR, зі своїм промотором P xylR .
Система була вставлена ​​у вектор pDG364 (Cutting, Horn, 1990), здатний інтегрувати з хромосомою B. subtilis в сайті amyE шляхом подвійного кросинговеру. Таким чином, отриманий вектор, позначений як pSWEET, дозволяє здійснювати вбудовування ксілозний системи експресії в хромосому B. subtilis . Для визначення ефективності функціонування даної системи експресії до її проксимальному кінця був пришитий репортерний ген bgaB - ген термостабільної b-галактозидази з B. stearothermophilus (отр...
