я гібридного білка в периплазматических простір клітини або культуральну середу;
- афінний компонент, істотно полегшує виділення гібридного білка.
При цьому обидва ці компонента можуть одночасно бути присутнім у складі гібридного білка. Крім цього, при створенні гібридних білків може використовуватися принцип мультімерной, (Тобто, в гібридному білку присутні кілька копій цільового поліпептиду), що дозволяє істотно підвищити вихід цільового продукту.
У Великобританії за допомогою E.coli синтезовані обидві ланцюга людського інсуліну, які потім були з'єднані в молекулу біологічно активного гормону. Щоб одноклітинний організм міг синтезувати на своїх рибосомах молекули інсуліну, необхідно забезпечити його потрібної програмою, тобто ввести йому ген гормону.
Хімічним спосіб отримують ген, що програмує біосинтез попередника інсуліну або два гени, що програмують окремо біосинтез ланцюгів А і В інсуліну.
Наступний етап - включення гена попередника інсуліну (або гени ланцюгів порізно) в геном E.coli - особливого штаму кишкової палички, вирощеного в лабораторних умовах. Це завдання виконує генна інженерія. p> З E.coli виокремлює плазміду відповідної рестриктазою. синтетичний ген вбудовується в плазміду (клонуванням з функціонально активної С-кінцевий частиною ОІ-галактозидази E.coli). В результаті E.coli набуває здатність синтезувати білкову ланцюг, що складається з галактозидази та інсуліну. Синтезовані поліпептиди отщепляют від ферменту хімічним шляхом, потім проводять і очищення. У бактеріях сінезіруется около100000 молекул інсуліну на бактеріальну клітину.
Природа гормонального речовини, що виділяється E.coli, обумовлена ​​тим, який ген вбудовується в геном одноклітинного організму. Якщо клонований ген попередника інсуліну, бактерія синтезує попередник інсуліну, який піддається потім обробці рестріктазами для відщеплення препітіда з вичленовуванням С-пептиду, внаслідок чого виходить біологічно активний інсулін.
Для отримання очищеного інсуліну людини виділений з біомаси гібридний білок піддають Хімкі-ферментативної трансформації і відповідної хроматографічної очищенню (Фпрнтальной, гельпронікающей, аніонообмінної). p> В Інституті РАН отримано рекомбінантний інсулін з використанням генно-інженерних штамів E.coli. з вирощеної біомаси виділяється попередник, гібридний білок, експрессіруемий в кількості 40% від усього клітинного білка, що містить препроінсулін. Перетворення його на інсулін in vitroосуществляется в тій же послідовності, що і in vivо - відщеплюється лідируючий поліпептид, препроінсулін перетворюється на інсулін через стадії окислювального сульфітоліза з подальшим відновним замиканням трьох дисульфідних зв'язків і ферментативним вичленовуванням зв'язує С-пептиду. Після низки хромотографіческіх очисток, що включають іонообмінні, гелеві та ВЕРХ, отримують людський інсулін високої чистоти і природної активності.
Можна використовувати штам з вбудованою ...
