оловку, до останньої приєднується вже зібраний відросток і утворюється нова фагова частинка . При упаковці молекули ДНК довжиною менше 38 т. п. н. виходить неинфекционная фагова частинка, а фрагменти довжиною більше 52 т. п. н. не поміщаються в голівку. Сегменти довжиною 50 т. п. н. в лінійній молекулі ДНК розділені cos-сайтами, і саме за цими сайтам розрізається молекула, коли черговий сегмент заповнює голівку. Розрізання здійснює фермент, що знаходиться біля входу в головку.
В результаті досліджень з вивчення збірки фага? була розроблена система упаковки молекул ДНК in vitro з утворенням інфекційних фагових частинок. Змішавши в пробірці очищені порожні головки, фагів ДНК і зібрані відростки, можна отримати інфекційні фагів частинки.
Завдання дослідника полягає втом, щоб замінити цей центральний ділянку нуклеотидної послідовністю довжиною приблизно 20 т. п. н. потрібної ДНК. ДНК, призначену для клонування, теж розщеплюють на фрагменти розміром від 15 до21 т. п. н. Обидва препарати - фагів і чужорідну ДНК - об'єднують і додають ДНК - лігази. Фрагменти ДНК довжиною 50 т. п. н. упаковуються в головки, до них приєднуються відростки і утворюються інфекційні фагів частинки. Фрагменти більшого (> 52 т. л. Н.) Або меншого (<38 т. п. н.) Розміру упаковуватися не можуть.
2.3 Косміди
Гібрид плазміди і фага. По суті справи, це просто плазмида, в яку додані сайти для зв'язування з білками оболонки фага (вони називаються cos-сайтами, і саме завдяки їм косміди отримали свою назву). Білкова оболонка робить косміду стабільніше, завдяки чому в неї можна завантажувати довші вставки.
Вектори, звані космідамі, можуть включати до 40 т. п. н. чужорідної ДНК і при цьому активно аміліфіпіціроваться в Е. coli як плазміди. Косміди об'єднують в собі властивості плазмідних векторів і векторів на основі фага?. Наприклад, широко застосовувана косміда pLFR - 5 (приблизно 6 т. п. н.) Має два cos-сайту фага?, Розділених сайтом рестрикції, полілінкерамі з шістьма унікальними сайтами рестрикції, точку початку реплікації ДНК (ori) і ген стійкості до тетрацикліну ( Тс). Ця косміда може інтегрувати чужорідну ДНК довжиною до 40 т. п. н. Препарати ДНК змішують і лигируют. Ті продукти легування, які містять вставку довжиною 40 т. п. н., Мають сумарний розмір, близький до 50 т. п. н., І, отже, можуть упаковуватися in vitro в головки фага?. Реассоцііровавшіе молекули pLFR - 5, не містять вставок, упаковані не будуть. Після складання фагових частинок інфікують ними Е. coli.
Опинившись в бактеріальної клітці, лінійна молекула з вставши?? Ой замикається в кільце завдяки спаровування cos-сайтів. У такій стабільній конфігурації вона може довгий час існувати в клітці і реплицироваться як гібридна плазмида, оскільки містить всі необхідні для цього елементи. Крім того, ген стійкості до тетрацикліну забезпечує зростання колоній, несучих дану косміду. Косміди мають велику перевагу порівняно з плазмідами: у них можна вбудовувати більш протяжні фрагменти, а це означає, що для створення геномної бібліотеки потрібно менше число клонів і буде потрібно менше часу на їх скринінг.
3. Escherichia coli (E. coli) - основна мо...
