ється від істинного значення. Різниця може становити від декількох кДа для низькомолекулярних білків до десятків кДа для високомолекулярних білків.
Буферні системи
Для електрофорезу білків у поліакриламідному гелі в якості буферних розчинів використовують: Тріс-HCl, Тріс-тріцін, TBE, TBE з сечовиною, Bis-Tris.
Електрофорез в агарозному гелі
Найбільш прості й зручні у використанні гелі агарози, яка представляє собою лінійний полісахарид. Освіта гелю йде шляхом зв'язування в просторову сітку пучків ниток, за рахунок утворення водневих зв'язків між ними. Завдяки механічної міцності і досить великому розміру пір, агарозній гелі знайшли широке застосування при поділі великих макромолекул, таких як ДНК. Варіюючи концентрацію агарози, можна міняти середній розмір пор в гелі, і при концентрації агарози в гелі понад 2% у ньому стає можливим розділяти не тільки НК, але й великі білкові молекули. Середній розмір пор 2% -ного гелю агарози приблизно відповідає розміру биополимера з масою 50 млн. Дальтон. Використовувати гелі більш високої концентрації не доцільно, тому що при електрофорезі пори гелю повинні бути легко проникні для молекул біополімерів, щоб лише гальмувати їх міграцію в електричному полі за рахунок тертя. Тому зазвичай застосовуються гелі з концентрацією 0.4 - 2%, а найбільш поширені Форез в гелях з концентрацією близько 1%.
агарозу розчиняється у воді при нагріванні в киплячій водяній бані. Розчиняти агарозу безпосередньо на нагрівачі слід при інтенсивному помішуванні, однак робити цього не рекомендується, щоб уникнути пригорання агарози до перегрітого дна посудини. В якості альтернативного способу, може використовуватися нагрів розчину в мікрохвильовій печі, що займає всього кілька хвилин. У цьому випадку, однак, необхідно уважно стежити за тим, щоб розчин не закипів, інакше він моментально втече raquo ;. Рекомендується нагрівати розчин на малої або середньої потужності, перемішуючи кожні півхвилини. Після застигання гель можна плавити повторно, однак робити це потрібно тільки на водяній бані або при акуратному нагріванні в мікрохвильовій печі. Деякі автори рекомендують при першому приготуванні гелю витримувати розплавлену агарозу на водяній бані або в термостаті не менше двох годин, для отримання істинного розчину полімеру.
Процес плавлення/застигання агарози має яскраво вираженим гістерезисом. Плавлення різних типів агарози зазвичай відбувається при температурах 85-95 °, тоді як застигання настає при температурах 38-40 °. Щоб уникнути значних теплових деформацій розплавлену агарозу заливають у форму охолодженої до 50-55 °. При проведенні кількісного аналізу розплавлений гель перед заливкою можна витримувати в термостаті при температурі 50 55 ° протягом двох годин. Це рекомендується робити для того, щоб після заливки у форму, гель застигав рівномірно по всьому об'єму. Застиглий гель чистої агарози не цілком прозорий і на вигляд трохи опалесцирует. З часом він кілька ущільнюється, витісняючи з себе рідину, з цієї причини агарозній гелі перед використанням рекомендується витримувати в буфері протягом 12 і більше годин.
Міграція ДНК в агарозному гелі.
Гелі агарози містять негативно заряджені групи, переважно сульфатні, повна кількість яких залежить від ступеня очищення агарози. Внаслідок цього, при електрофорезі позитивно заряджених молекул може виникати їх неспецифічне взаємодія з волокнами гелю, яке проявлятися у вигляді розтягування зон, при оборотному зв'язуванні з негативними групами гелю, або у вигляді затримки, якщо взаємодія необоротне. Крім того, присутність негативно заряджених груп призводить до виникнення електроосмосу, який викликає протитечія рідини усередині гелю, що однак ускладнює розрахунок їх електрофоретичної рухливості. За деякими даними, при використанні різних типів агарози дня поділу трьох форм плазмідної ДНК (суперспіральной, релаксированной кільцевої та лінійної) спостерігаються сильні зміни швидкості міграції молекул, і що ще важливіше, змінюється взаємне розташування смуг, відповідних різним формам ДНК, в гелі. Для кількісного опису величини електроосмосу в агарозних гелях використовують коефіцієнт відносної міграції який дорівнює відношенню швидкостей міграції незарядженого полімеру (тільки за рахунок електроосмосу) і аналогічного за структурою поліаніонній при електрофорезі в агарозному гелі даного тина. Зазвичай виділяють три типи агарози: з низькою, середньою і високим ступенем електроосмосу.
Крім обліку ефектів електроосмосу, важливо також правильно підібрати розміри пор гелю і напруженість електричного поля, в залежності від властивостей досліджуваного зразка. Дня оптимального поділу ДНК в агарозному гелі необхідно створити умови, при яких молекули ДНК можуть досить вільно мігрувати в гелі...
