рацію поліакриламіду від 2 до 8%. Розділяючий гель має рН в районі 8,5-9 і концентрацію поліакриламіду від 5 до 20%. Вибір щільності гелю залежить від молекулярних мас досліджуваних білків. Всі буфери не містять неорганічних солей, основним переносником струму в них є гліцин. При рН 6,8 сумарний заряд молекули гліцину близький до нуля. Внаслідок цього для перенесення певного заряду (який визначається силою струму в електрофоретичної комірці), негативно заряджені комплекси поліпептидів з SDS повинні рухатися з великою швидкістю. При рН 8,8 гліцин здобуває негативний заряд, внаслідок чого на кордоні концентрирующего і розділяє гелів білки різко гальмуються (в перенесенні однакового заряду через одиницю площі тепер бере участь набагато більше заряджених молекул, отже, вони рухаються з меншою швидкістю). Результатом цього є концентрування білків на кордоні гелів, що дуже сильно підвищує роздільну здатність методу.
У розділяючому гелі білки мігрують в залежності від довжини поліпептидного ланцюга, тобто обернено пропорційно молекулярній масі.
Механізм поділу
Електрофоретична рухливість біополімерів в гелі залежить від ряду параметрів. Швидкість міграції пропорційна заряду молекули, і в вільної рідини молекули з однаковим питомим зарядом мігрують з рівною швидкістю. У разі поділу в середовищі, що має жорстку просторову матрицю, відбувається сегрегація за рахунок тертя об гель. Сила тертя залежить від просторової конфігурації молекули, у тому числі від її розміру. Таким чином, у разі електрофоретичного розділення нативних білків буде спостерігатися складна картина їх розподілу залежно від вищенаведених факторів.
Візуалізація продуктів розділення
Для візуалізації результатів електрофорезу найчастіше використовують фарбування білків в гелях барвником Кумассі або сріблом. Для проведення вестерн блоттинга білки переносять з гелю на нітроцелюлозну мембрану.
Інтерпретація результатів
У більшості випадків результати електрофоретичного розділення достатньо отримати шляхом візуальної оцінки гелю. Проте, з метою отримання достовірних даних та належного документування результатів, гель сканують на просвіт за допомогою високочутливого денситометра. По суті, денситометр є сканером, який відноситься до контрольно-вимірювальних приладів та підлягає повірці з метою визначення та підтвердження відповідності характеристик засоби вимірювання встановленим вимогам. Подібні вимоги до денситометрах дозволяють надійно визначати не тільки положення білків в гелі, але і оптичну щільність білкового плями. Оцифроване зображення гелю обробляють за допомогою спеціалізованого програмного забезпечення, яке дозволяє достовірно визначити такі параметри як електрофоретична рухливість білка, його чистота, кількість білка в плямі та ін. Визначення молекулярної маси досліджуваного білка передбачає необхідність калібрування гелю по молекулярним масам. Калібрують гель щодо молекулярних мас білків-маркерів, які поділяють паралельно з досліджуваним зразком. Суміші маркерних білків доступні в різному інтервалі мас. Калібрування передбачає побудови залежності відносної електрофоретичної рухливості (Rf) кожного з маркерних білків від десяткового логарифма їх молекулярної маси. Зазвичай залежність має вигляд сигмоподібної кривої. Розрахунок молекулярної маси досліджуваного білка здійснюють щодо його Rf, використовуючи при цьому метод регресійного аналізу. Достовірними результати вважаються, у випадку якщо довжина пробігу білків-маркерів становить не менше 80% довжини розділяє гелю, а залежність їх Rf від логарифма молекулярної маси є лінійною (R2 gt; 0,95). Тобто для розрахунків використовують лише ту ділянку калібрувальної кривої, який покриває електрофоретична рухливість досліджуваного білка.
Чутливість методу SDS-PAGE по Леммлі обернено пропорційна молекулярній масі білка. Наприклад, в інтервалі 10-20 кДа вдається розділити білки, що відрізняються всього на 0,1 кДа (різниця всього в один амінокислотний залишок). Проте, для отримання задовільних результатів слід виконати кілька простих методичних рекомендацій. Так, у зв'язку з тим, що висока електропровідність досліджуваних зразків здатна значно спотворити електрофоретична рухливість білка, їх іонна сила повинна бути по можливості мінімальною і приблизно рівною. Ще однією важливою умовою надійності визначення молекулярної маси є оптимальне навантаження білка на гель. При фарбуванні Coomassie Blue R250 оптимальний вміст білка в плямі повинно знаходитися в межах 0,1-1 мкг і як мінімум на порядок менше при фарбуванні сріблом. В іншому випадку білки в гелі сформують широкі плями, що в свою чергу утруднить визначення їх електрофоретичної рухливості. Незважаючи на високу чутливість і нескладність методу молекулярна маса білків, визначена з використанням SDS-PAGE, часто відрізня...
