ликої краплі крові, палець кілька разів притискують до поверхні Whatman FTA Classic Card. Потім зразок висушують при кімнатній температурі. Після цього готовий зразок зберігають при кімнатній температурі в індивідуальному конверті під номером, з описом даних донора.
Взяття зіскрібка з внутрішньої сторони щоки проводиться за допомогою набору, що містить індивідуальний аплікатор, упакований в пластик (9х15 см), і поміщений в опломбований пакет. Зразок висушують, пакети сново пломбують. Готовий зразок можна зберігати при кімнатній температурі.
Приготування зразків
З кожного фіксованого зразка вирізують круглий ділянку діаметром 3 мм. Вирізаний ділянку тричі покривають метанолсодержащім складом, потім висушуючи на повітрі в перший раз при кімнатній температурі протягом 20 хвилин, потім двічі - при температурі 37 ° С протягом 40 хвилин. Метанол стимулює преципитацию гема до паперу.
За допомогою щипців висохлі зразки переносять у тонкостінні (0,2 мл) ПЛР-пробірки і доливають 5 ?л буфера і 45 ?л дист. води. Зразки інкубують послідовно при 60 ° С протягом 30 хвилин; 99,9 ° С протягом 10 хвилин; 4 ° С до охолодження.
Перед початком інкубації додають протеинкиназу К (50 мкг / мл), яка інактивується при температурі 99,9 ° С. Це дозволяє поліпшить збереження генетичного матеріалу.
2.3 Аллельспеціфічная ПЛР
Для ефективного здійснення ПЛР 3'-кінцевий нуклеотид праймера повинен бути комплементаріїв відповідному нуклеотиду матричної ДНК. В іншому випадку ефективність подовження праймера під час ПЛР різко знижується і при певних поєднаннях помилково спарених нуклеотидів може відсутні взагалі. Саме ця особливість ПЛР і лежить в основі методу виявлення мутацій за допомогою аллель-специфічної ПЛР, інакше званої аллель-специфічної елонгацією праймера (allele specific primer extension) [15].
Другий тип універсальних аллель-специфічних праймерів містить 3 «-кінцевий нуклеотид, завжди некомплементарни матриці, а мутантний нуклеотид матриці потрапляє в його внутрішню частину. У цьому випадку продукти ПЛР відсутні, якщо в гібриді у внутрішню частину праймера потрапляє будь некомплементарни мутантний нуклеотид матричної ДНК незалежно від його точної локалізації. Такі праймери дозволяють виявляти будь-які точкові мутації в гомозиготному стані і у гаплоїдних мікроорганізмів. Для виявлення гетерозиготного стану аналізованого гена іноді використовують мутантний і нормальний праймери різних розмірів, які розрізняються по довжині їх 5 »-кінцевих послідовностей, повністю комплементарних аналізованої ДНК. У цьому випадку в процесі ПЛР в реакційну суміш можна одночасно додавати обидва аллель-специфічних праймера: мутантний і нормальний разом із загальним для обох праймерів - зустрічним. Утворилися продукти реакції, відповідні мутантного аллели і аллели дикого типу, далі розділяють електрофоретично в гелях, що використовуються для секвенування нуклеїнових кислот.
При використанні аллель-специфічних праймерів для виявлення мутацій необхідно мати на увазі, що не всі поєднання помилково спарених з матрицею 3 «-кінцевих нуклеотидів однаково ефективні в блокуванні ПЛР. Найменшою здатністю до елонгації праймерів з помилково спареними 3 »-кінцевими нуклеотидами володіє так званий фрагмент Шоффлера Taq-полім...
