ерази, який являє собою молекулу ДНК-полімерази T.aquaticus, вкорочену з N-кінця на кілька десятків амінокислотних залишків. У той же час у цьому методі не застосовні термостабільні ДНК-полімерази, що володіють 3 «-> 5»-коректує активністю, наприклад Vent-полімераза [16].
Для проведення практичної частини було відібрано 43 проби. З них 23 - пацієнти з діагностованим раком молочної залози (група дослідження), і 20 здорових жінок (група контролю).
У практичній частини для проведення аллелеспеціфічной ПЛР з детекцією форм гена ГСТТ була використана реакційна суміш (20 мкл на пробу) з наступним складом:
КомпонентКонцентрація 1 х буфер з KCl (pH=8,8) (20mM TrisHCL, 67mM (NH?)? SO? 0,01% Tween 20) MgCL? 3 mMdNTP0, 3 mMTaq-полімераза0, 5 mMПраймер 1 (FWD) 5 pmolПраймер 2 (RFV) 5 pmolГеномная ДНК50 - 100 ng
Для приготування проби компоненти реакційної суміші були взяті в таких пропорціях:
КомпонентКолічество (мкл / проба) Буфер з KCl2MgCL? 1,2 dNTP0, 6Праймер 1 (FWD) 0,032 Праймер 2 (RFV) 0,033 Taq-полімераза0, 1Taq-полімераза14, 035Геномная ДНК2
Для постановки реакції ампліфікації використовувався ПЛР-ампліфікатор Primus 96 advanced GRADIENT (PEQLAB Німеччина). Цей ампліфікатор дозволив підібрати оптимальну температуру відпалу праймерів використовуються в даній роботі, завдяки функції градієнта температур, встановленого в необхідному температурному інтервалі.
Аналіз проводився за двома поліморфізму - ГСТТ1 (кон'югується) і ГСТТ1 0/0 (некон'югірующій). Нами була використана методика постановки аллелеспеціфіческого ПЛР - метод визначення поліморфізму з точністю до одиничного нуклеотиду [15].
Температурний режим, обраний для ампліфікації
ТемператураВремя 95 ° С5 мін95 ° С30 сек35 ціклов62 ° С30 сек72 ° С30 сек72 ° С4 мін4 ° Спауза
Після закінчення ампліфікації проводилася детекция кінцевих продуктів реакції.
.4 Детекція продуктів ПЛР
Детекція продуктів ПЛР проводиться із застосуванням вертикального і горизонтального електофореза. Великий вплив на ефективність ампліфікації надає ступінь чистоти препарату ДНК, тобто наявність в реакційній суміші тих чи інших інгібіторів, від яких позбутися в деяких випадках буває вкрай складно. Іноді, через їх присутності не вдається ампліфікувати навіть десятки тисяч молекул ДНК-мішені. Таким чином, прямий зв'язок між вихідною кількістю ДНК-мішені і кінцевим кількістю продуктів ампліфікації часто відсутня.
Результати ампліфікації оцінювалися шляхом проведення горизонтального електрофорезу (камера і блок живлення Peqlab) в 3% агарозному гелі в одноразовому TRIS - борат-ЕДТА буфері (1xTBE).
В одну з лунок вносився маркер молекулярної ваги («Праймтех», РБ), який дозволяє визначати молекулярну вагу амплікон.
Час проведення електрофорезу залежить від молекулярної маси ампліфікованого продукту. У нашому випадку час електрофорезу становило в середньому 60 хвилин.
Аналіз гелів проводився за допомогою трансілюмінатора CN - 1000 Darcroom (Vilbcr Lourmal, Німеччина) з оригінальним програмним забезпеченням.
...
