довжиною 3 см з окремих рослин і сушать при 40 0 ??С;
- подрібнюють матеріал за допомогою механічного гомогенізатора;
- у пробірки з гомогенатом додають 300 мкл попередньо розігріту суміш СТАБ буфера з меркаптоетанолом у співвідношенні 7 мкл меркаптоетанол на 5 мл СТАБ буфера;
- поміщають пробірки з матеріалом у водяну баню на годину при 65 0 С;
- охолоджують пробірки до кімнатної температури;
- додають 150 мкл хлороформу;
- ставлять на гойдалку і мещают протягом 15 хвилин;
- пробірки з матеріалом центрифугують 5 хвилин при 15 тис.g;
- відбирають 120 мкл надосадової рідини в чисті пробірки;
- додають 150 мкл попередньо охолодженого до - 20 0 С 70% розчину етанолу;
- перемішують і поміщають матеріал в холодильник при - 20 0 С на 5-10 хвилин;
- матеріал у пробірках центрифугують 5 хвилин при 15 тис.g;
- зливають надосадову рідину і додають 200 мкл 70% розчину етанолу;
- сушать матеріал 15-20 хвилин;
- додають 100-200 мкл бідістілірованной води;
- розчиняють матеріал при 4 0 С протягом ночі;
. 3 ПЛР аналіз ліній пшениці
Ідентифікацію Lr-генів здійснювали з використанням ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція), з праймерами, маркованими окремі гени. Праймери відбирали на підставі літературних даних, нуклеотидні послідовності представлені в таблиці 2.
Реакційна суміш об'ємом 25 мкл містила 1x PCR buffer (50мм До Cl, 20 мМ трис-Н Cl, рН 8,4, 2-5 мМ Мg Cl2, 0,01% твін - 20), 2 mM MgCl 2, по 0,2 мМ кожного dNTP, 12.5 pmol кожного праймера, 50 нг ДНК та 1 од. Taq-полімерази. Ампліфікацію вели згідно з умовами, рекомендованим авторами, з незначними модифікаціями [Brown-Guedira, Singh; Petsova et al., 2000].
Продукти ампліфікації розділяли електрофорезом в 2% агарозному гелі в 0,5 х ТВЕ-буфері. Гелі фарбували бромистим етидієм і фотографували в ультрафіалетовом світлі c допомогою фотобокса «INFINITI 1000».
Таблиця 2 - Характеристика праймерів, зчеплених з генами стійкості до листової іржі [Гультяева, 2012]
ГенПраймерПоследовательность нуклеотідовLr 39GDM35-LCCTGCTCTGCCCTAGATACGGDM35-RATGTGAATGTGATGCATGCALr 50GDM87-lAATAATGTGGCAGACAGTCTTGGGDM87-rCCAAGCCCCAATCTCTCTCTLr 9FJ13/1CCACAСTACCCCAAAGAGACGRJ`13/2TCCTTTTATTCCGCACGCCGGLr35BCD260F1GAAGTTAAAGAGGTCTTGAC35R2TTTTGAGAATCAGTCATCACLr 47PS10RGCTGATGACCCTGACCGGTPS10LTCTTCATGCCCGGTCGGGTLr21D14LCGCTTTTACCGAGATTGGTCD14RCCAAAGAGCATCCATGGTGTLr51S30-13LGCATCAACAAGATATTCGTTATGACCAGA7-759RTGGCTGCTCAGAAAACTGGACC
В якості маркера молекулярної маси використовували ДНК маркер М 24100 bp виробництва «СібЕнзім».
В якості позитивних контролів для визначення відомих генів були використані синтетичні форми і дикі родичі.
В якості негативного контролю використовували сприйнятливий до листової іржі сорт Аврора.
Таблиця 3 - Умови ПЛР для праймерів, використаних в роботі [Гультяева, 2012]
Маркер до генуУсловія ампліфікацііМол. вага продуктаLr +3994 04 хв. 35 циклів (94 0 30 сек .; 550 30 сек.; 720-30сек.) 72 05 мін.160Lr 5094 04 хв. 30 циклів (94 0 30 сек .; 600 30 сек.; 720-30сек.) 72 05 мін.110Lr 994 ° 6 хв; 30 циклів (92 ° 30 с, 68 ° 30 с, 72 ° 60 с); 72 ° 5 мін1100Lr3594 ° 3 хв; 35 циклів (94 ° 45 с, 60 ° 45 с, 72 ° 60 с); 72 ° 7 мін900Lr 4794 ° 5 хв; 35 циклів (94 ° 45 с, 61 ° 30 с, 72 ° 30 с); 72 ° 7 мін282Lr 2194 ° С 5 хв., 30 циклів (94 ° С - 1 хв, 50 ° - 1 хв., 72 ° С - 2хв.), 72 ° С - 5 мін.885Lr +5194 ° C 4 хв, 40 циклів (94 ° C - 45 с, 52 ° C - 45 с, 72 ° C - 60 с), 72 ° C - 10 мін.783
. 4 Рестрикція
Для ідентифікації потрібного нам фрагмента після ампліфікації реакцій на гени Lr21 і Lr51 було необхідно провести рестрикцию реакційної суміші.
Для гена Lr51 була використана рестриктаза Pst I з сайтом впізнавання 5 ... CTGCA? G ... 3; 3 ... G? ACGTC ... 5. Умови рестрикції були наступними:
х SE-Буфер О, BSA (100 мкг/мл);
Інкубувати 1:00 при 37 ° С.
Після рестрикції утворюється фрагмент, довжиною близько 400 п.н.
Для ідентифікації фрагмента, зчепленого з геном Lr21 була використана рестриктаза MSP1 з сайтом впізнавання 5 ... C? CGG ... 3; 3 GGC? C. Умови рестрикції були наступними:
x SE Буфер O, BSA (100 мкг/мл);
Інкубувати ...
