ухлин. Це дає цілий ряд переваг:
- можна проводити великі ретроспективні клінічні дослідження;
- значно спрощується вивчення рідко зустрічаються патологій;
- парафінові зрізи легко транспортувати, що дозволяє проводити цитометрические дослідження в спеціальних центрах.
Недоліки методу полягають у тому, що:
- якість одержуваних результатів, як правило, не дуже високе;
- не можна використовувати внутрішній ДНК-стандарт.
Якість результатів можна підвищити, якщо трохи вдосконалити фіксацію тканин (CEGillett, RSCamplejohn, SMO'Reily, 1990). Хороший ефект дає фіксація в формаліні при нейтральному рН при 4 Вє С протягом ночі. Слід уникати нагрівання тканини (якщо тільки вона не є абсолютно необхідним при її обробці) або невиправдано тривалої фіксації.
Фарбування ДНК
При фарбуванні клітинної ДНК з метою подальшого визначення її змісту за допомогою проточної цитометрії слід враховувати:
- специфічність барвника стосовно ДНК;
- його спектральні характеристики: інтенсивність флуоресценції і можливість її реєстрації наявними в продажу приладами;
- вартість і зручність у роботі (розчинність, стабільність і т.д.)
Цим вимогам відповідає цілий ряд флуорохромов. Детальний їх опис дано в роботах Waggoner A.S. (1990), Crissman H.A., Steincamp J.A. (1990), Laff S.A., Langolis R.J. (1990). У проточній цитометрії для фарбування ДНК частіше інших флуорохромов використовується іодістий пропідій (ІП) навіть незважаючи на те, що він не строго специфічний по відношенню до ДНК. З допомогою ІП можна фарбувати також двухцепочечную РНК. Спектральні характеристики ІП дуже зручні для проточної цитометрії: для порушення флуоресценції використовується звичайний аргоновий лазер з робочою довжиною хвилі 488 нм, а максимум флуоресценції знаходиться поблизу 620 нм, що дозволяє паралельно використовувати флуоресцеїн при проведенні багатопараметричних вимірювань.
Незалежно від барвника останній повинен перебувати з ДНК в стехиометрических співвідношеннях, тобто кількість зв'язаного з ДНК барвника повинно бути пропорційно вмісту ДНК у клітині. Щоб барвником були зайняті всі доступні для зв'язування місця, його слід брати в деякому надлишку.
Більшість флуоресціюючих барвників, що зв'язуються з ДНК, у тому числі і ІП, не можуть проходити через мембрани інтактних клітин. Щоб підвищити проникність мембран, клітини або фіксують спиртом, або обробляють детергентами.
Використання інший ДНК в якості стандарту.
Зміст ДНК, якій відповідає один з піків на ДНК-гістограмі для досліджуваного препарату, можна оцінити, порівнявши цей пік з піком для іншої ДНК, зміст якої відомо. Так, порівняння лівого піка на мал.1 з піком, що відповідає ДНК диплоїдних лімфоцитів периферичної крові людини, говорить про те, що ми маємо справу з диплоїдними клітинами. У доповіді Комітету по номенклатурі в аналітичної цитометрі...
