ь для визначення наявності ендотоксинів, джерелом яких є грамнегативні бактерії, з використанням лізата амебоцитів мечехвоста Limulus polyphemus.
Існує три принципи проведення даного випробування: принцип гель-тромбу, заснований на освіті гелю; турбідиметрично принцип, заснований на помутнінні в результаті розщеплення ендогенного субстрату; хромогенний принцип, заснований на появі забарвлення після розщеплення синтетичного пептидно-хромогенного комплексу.
Випробування виконують в умовах, що не допускають забруднення сторонніми ендотоксинами. Всю скляний посуд та іншу термоустойчивую апаратуру депірогенізіруют в сухожарові шафі з використанням процесу з підтвердженою ефективністю. Загальноприйняті мінімальні значення часу і температури обробки, складові 30 хвилин і 250 В° С, відповідно. При використанні пластикової апаратури, наприклад, мікротитраційними планшетів і наконечників для автоматичних піпеток, слід продемонструвати відсутність на ній піддаються визначенню ендотоксинів і заважають факторів.
Вихідний стандартний розчин ендотоксину готують і зберігають, слідуючи специфікаціям, наведеним на листку-вкладиші та етикетці.
Приготування випробовуваних розчинів. Піддослідні розчини готують шляхом розчинення або розведення активних субстанцій або медичної продукції з використанням води для випробування на бактеріальні ендотоксини ІБЕ.
При необхідності, доводять значення рН випробуваного розчину (або його розведення) так, щоб рН його суміші з лізатів знаходилося в інтервалі, наказаному виробником лізата.
Визначають максимально допустиме розведення (МДР) - максимальне розведення зразка, при якому може бути визначено граничний вміст ендотоксину.
Межа ендотоксину для активних субстанцій, призначених для парентеральноговведення, вказується в приватних статтях і виражається в таких одиницях, як МО/мл, МО/мг, МО/(одиниця біологічної активності) тощо
Принцип гель-тромбу.
Гель-тромб-методи дозволяють визначати наявність і кількість ендотоксинів і грунтуються на ефекті згортання лізата у присутності ендотоксинів. Концентрація ендотоксинів, що вимагається для згортання лізата в стандартних умовах, являє собою зазначену на етикетці чутливість лізата. Для забезпечення точності та достовірності випробування зазначену чутливість лізата слід підтвердити, а також провести випробування на що заважають чинники.
Попередні випробування: підтвердження заявленої чутливості лізата. Перед використанням лізата у випробуваннях зазначену на етикетці чутливість, виражену в МО/мл, слід підтвердити в чотирьох повторностях.
Готують стандартні розчини не менше, ніж чотирьох концентрацій. У кожній з пробірок змішують розчин лізата з рівним об'ємом одного з стандартних розчинів (Наприклад, по 0,1 мл кожного). Якщо використовуються одноразові флакони або ампули з ліофілізованим лізатів, розчини додають безпосередньо в ампулу або флакон. Реакційну суміш інкубують протягом певного періоду, в відповідно до рекомендацій виробника лізата (зазвичай 37 В± 1 В° С протягом 60 В± 2 хвилин), уникаючи вібрації. Досліджують цілісність гелю: при використанні пробірок кожну з них по черзі витягують з інкубатора і перевертають одним плавним рухом приблизно на 180 В°. Якщо утворюється твердий гель, що залишається на своєму місці після перевертанні, результат записують як позитивний. Результат негативний, якщо неушкодженого гелю не утворюється. p> Результати випробування вважають достовірними, якщо нижча концентрація стандартних розчинів у всіх повторностях дає негативний результат.
За кінцеву точку приймають останній позитивний результат у низхідному ряду концентрацій ендотоксин. Обчислюють середнє значення логарифмів концентрацій в кінцевих точках і, потім, антилогарифмів цього середнього значення. Середній геометричне концентрацій в кінцевих точках являє собою виміряну чутливість розчину лізата (МО/мл). Якщо це значення становить не менше 0,5 О» і не більше 2О», чутливість, зазначену на етикетці, вважають підтвердженої і використовують у випробуваннях, виконуваних з цим лізатів.
Граничне випробування. Методика. Готують розчини A, B, C і D відповідно до Таблиці в ГФРБ і виконують випробування для цих розчинів у відповідності з вказівками підрозділу "Попередні випробування "," Підтвердження чутливості лізата, вказаної на етикетці ".
Розчини А і В (позитивний контроль з препаратом) готують у розведеннях не вище МДР і обробляють відповідно до вказівок підрозділів "Попередні випробування", "Визначення чинників, що заважають". Розчини В і С (позитивні контролі) містять стандарт ендотоксину в концентрації, що відповідає дворазової заявленої чутливості. Розчин D (негативний контроль) являє собою воду для ІБЕ.
Інтерпретація. Результати випробування вважають достовірними, якщо позитивні контрольні розчини В і С в обох повторностях дають позитивний результат, а розчин D - негативний результат.
Вип...
