0,1 мл суспензії мікросом. Якщо екстинкція вище, то необхідно суспензія мікросом розбавити трис-буфером так, щоб вийшла потрібна концентрація білка. p> У дослідну і контрольну пробірки вносять по 0,4 мл розчинів трис-буфера і хлориду магнію, по 0,2 мл НАДФ В· Н і по 0,1 мл суспензії мікросом. Перемішують вміст пробірок. br/>В
В дослідну пробу додають 0,11 мл розчину амідопірину, а в контрольну - спочатку по 0,25 мл розчинів сульфату цинку і гідроксиду барію, а потім 0,11 мл амідопірину. Вміст перемішують. p> Поміщають обидві пробірки на 20 хв у водяну баню при 37 Вє С, періодично струшуючи проби. По закінченні інкубації реакцію у дослідній пробі зупиняють, додавши по 0,25 мл розчинів сульфату цинку і гідроксиду барію. Вміст перемішують. p> Центрифугують обидві проби при 3000 об/хв протягом 10 хв.
Відбирають по 1 мл надосадової рідини в дві інші пробірки і доливають у них по 2 мл реактиву Наша. Ставлять проби на 45 хв у водяну баню при 37? С.
Вимірюють екстинкцію дослідної проби проти контрольної на СФ при 412 нм в кюветі з товщиною шару 1 см.
Розрахунок проводять за формулою:
аV1, 71.333
х = ----------,
20.0, 1.1000
де х - швидкість N-деметилювання амідопірину, мкмоль/(хв В· кг печінки);
а - кількість формальдегіду, знайдене за калібрувальним графіком (рис.12), нмоль; - обсяг суспензії мікросом у трис-буфері, мл;
, 71 - обсяг інкубаційної суміші, мл;
, 1 - обсяг суспензії мікросом, взятий на дослідження, мл;
- час інкубації, хв;
- коефіцієнт перерахунку на 1кг тканини печінки;
- коефіцієнт перерахунку нмоль в мкмоль.
Оформлення роботи. Розрахувати швидкість мікросомального окислення амідопірину. У висновку вказати на значення цього процесу. p align="justify"> Практичне значення роботи. Дослідження окислення ксенобіотиків монооксигеназної ланцюгом мікросом дає можливість оцінити функцію цього процесу в нормі та патології, а також вивчити особливості перетворення різних сполук, токсичність і дія їх продуктів на організм. br/>
Робота 102. Визначення гідроксилазних активності мікросом печінки по Като і жилети
Реактиви. Тріс-HCl буфер, 0,08 М розчин з рН 7,4 *; хлорид магнію, 0,16 М розчин; анілін перегнаний, 0,03 М розчин; трихлороцтової кислота, 15%-ний розчин; карбонат натрію, 10% - ний розчин; фенол, 2%-ний розчин в 0,2 М розчині гідроксиду натрію; НАДФ? Н, 0,03 М розчин; біуретового реактив *; гідроксид натрію, 3%-ний розчин; реактиви для виділення мікросом, як в роботі 86; 4-аминофенол, свіжоприготований розчин для побудови калібрувального графіка. (5,45 мг/л). p align="justify"> Обладнання. Штатив із пробірками; піпетки місткістю 0,1; 0,2; 1 і 5 мл; водяна баня; лабораторна центрифуга з Центрифужна вагами; центрифуга рефрижераторна ЦЛР; ФЕК типу КФК-2 або спектрофотометр. p align="justify"> Матеріал. Печінка тварини після забою. p align="justify"> Метод заснований на визначенні вмісту 4-амінофенолу, що утворюється при гідроксилюванні аніліну в монооксигеназній ланцюга мікросом і за участю цитохрому Р450:
В
-аминофенол при взаємодії з фенолом і в присутності карбонату натрію утворює забарвлений індофенольний комплекс синього кольору:
В
Хід визначення. Виділяють фракцію мікросом печінки, як зазначено в роботі 100, потім визначають вміст білка в отриманій мікросомальної фракції; для цього відбирають 0,05 мл суспензії мікросом в пробірку, додають 3,95 мл розчину гідроксиду натрію і 0.2 мл біуретового реактиву. p> Перемішують вміст скляною паличкою і через 30 хв вимірюють екстинкцію цього розчину проти контрольного (4 мл гідроксиду натрію і 0,2 мл біуретового реактиву) на ФЕК і СФ при 330 нм в кюветі з товщиною шару 1 см. Розраховують концентрацію білка за калібрувальним графіком (вміст білка в 0,1 мл суспензії мікросом має становити приблизно 2-4 мг).
Для вивчення гідроксилювання аніліну беруть дві чисті пробірки і готують контрольну і дослідну проби. Послідовність внесення компонентів і їх обсяг наведені в таблиці. P буфер0, 4Тріс-HCI буфер0, 4Хлорід магнія0, 4Хлорід магнія0, 4Взвесь мікросом0, 1НАДФ? Н0, 2Тріхлоруксусная кіслота0, 5Взвесь мікросом0, 1Анілін0, 11Анілін0, 11НАДФ? Н0, 2
Обидві пробірки поміщають на 20 хв у водяну баню при 37 Вє С, після чого в дослідній пробі зупиняють реакцію, доливаючи 0,5 мл трихлороцтової кислоти. Далі обидві проби центрифугують 10 хв при 3000 об/хв. p align="justify"> Відбирають з кожної проби по 1 мл надосадової рідини, переносять їх у дві інші пробірки. Потім доливають до них по 0,5 мл карбонату натрію і по 1,5 мл розчину фенолу. Перемішують вміст струшуванням. p align="justify"> Для розвитку забарвлення пробірки поміщають на 30 хв у водяну баню при 37? С. Потім в...
