полуки.
В експериментах застосовують обидва підходи; в клініці метаболізм лікарського засобу оцінюють, як правило, за вмістом у біологічних рідинах досліджуваного речовини і його продуктів обміну. ​​
1. Дослідження процесів окислення і кон'югації ксенобіотиків
Робота 100. Виявлення дихальної активності мікросом
Дихання мікросом - процес окислення речовин киснем з утворенням води - можна вивчати або за швидкістю споживання кисню, або з використання відновленого НАДФ, або НАД, що беруть участь в цих реакціях.
Реактиви. Хлорид калію, 1,15%-ний розчин; трис-буфер, 0,1 М розчин з рН 7,4 *; хлорид кальцію, 0,04 М розчин; НАДФ В· Н, 1,0 мМ розчин, свіжоприготований; НАД В· Н, 1,0 мМ розчин, свіжоприготований.
Обладнання. Піпетки місткістю 0,1; 1, 5, 10 мл; штатив із пробірками; скляні палички; чашки Петрі; мірний циліндр місткістю 25мл; фільтрувальний папір; шприц з голкою; гомогенізатор з товкачиком з тефлону; аптечні ваги з важками; моторчик для гомогенізації ; флуороскопа; центрифуга ЦЛР.
Матеріал. Печінка (свіжа) забитої тварини. p align="justify"> а. Виділення мікросомальної фракції з печінки щура. Метод заснований на різній швидкості осадження субклітинних частинок печінки при центрифугировании залежно від їх розміру та щільності. Для зменшення фактора осадження мікросом додається хлорид кальцію, що викликає їх преципитацию. p align="justify"> Хід визначення. Після забою тварини печінку відмивають від крові розчином хлориду калію з шприца, обсушують її фільтрувальної папером і поміщають в чашку Петрі, що стоїть на льоду. p align="justify"> г тканини печінки подрібнюють ножицями і переносять у склянку гомогенізатора, куди попередньо наливають 9 мл охолодженого розчину хлориду калію. Стакан поміщають в лід і роздрібнюють тканину за допомогою тефлонового маточки при 1000 об/хв, роблячи 15-20 рухів ста каном вгору-вниз.
Гомогенат розливають у дві центрифужні гільзи і центрифугують на ЦЛР при 10000g протягом 20 хв при 0-4? С. Надосадову рідину зливають в інші центрифужні гільзи, додають до неї розчин хлориду кальцію в співвідношенні 1:5 за об'ємом. Перемішують і знову центрифугують при 3000g протягом 15 хв при 0-4? С.
Надосадову рідину зливають. До осаду, що містить збагачену фракцію мікросом, додають 3 мл розчину трис-буфера і за допомогою піпетки, втягуючи і видуваючи рідина, отримують суспензію мікросом. p align="justify"> б. Виявлення дихальної активності мікросом печінки флуориметричним методом. Метод заснований на спостереженні за швидкістю падіння флуоресценції НАДФ В· Н або НАД В· Н в процесі їх окислення препаратами мікросом. p align="justify"> Хід визначення. У дві пробірки наливають по 2,8 мл трис-буфера. Потім в одну з них додають 0,1 мл отриманої суспензії мікросом, а в іншу - 0,1 мл дистильованої води (контрольна проба). p align="justify"> Ставлять обидві пробірки в штатив попередньо включеного флуороскопа, вносять до них по 0,1 мл розчину НАДФ В· Н або НАД В· Н і швидко перемішують скляною паличкою.
Спостерігають за зміною флуоресценції в обох пробах.
Оформлення роботи. По зміні флуоресценції вказати на наявність дихальної функції мікросом. p align="justify"> Практичне значення роботи. Виділення мікросом використовується в наукових дослідженнях для вивчення їх функцій, в тому числі дихальної, при різних фізіологічних станах і при патології, а також для дослідження дії ліків і отрут. br/>
Робота 101. Дослідження окисного N-деметилювання в мікросомах печінки по Нашу
Реактиви. Гідроксид натрію, 3%-ний розчин; біуретового реактив *; трис-буфер, 0,1 М розчин з рН 7,4 *; НАДФ В· Н, 1 мМ розчин, свіжоприготований; хлорид магнію, 2,5 мкМ розчин; амідопірин, 80 мМ розчин; сульфат цинку, 25%-ний розчин; гідроксид барію, насичений розчин; реактив Наша *.
Обладнання. Штатив із пробірками; піпетки місткістю 0,1, 1, 2 і 5 мл; спектрофотометр. p align="justify"> Матеріал. Суспензія мікросомпечінки, отримана в роботі 85, а. p align="justify"> Метод заснований на вимірюванні вмісту в середовищі формальдегіду, що утворюється при окислювальному N-деметилювання амідопірину в мікросомах:
В
Формальдегід дає з реактивом Наша комплекс жовтого кольору.
Хід визначення. Перевіряють вміст білка в мікросомальної фракції, для чого поміщають в пробірку 0,05 мл суспензії мікросом, додають 3,95 мл розчину гідроксиду натрію і 0,2 мл біуретового реактиву. Суміш перемішують і через 30 хв вимірюють екстинкцію дослідної проби проти контрольної (4 мл розчину NaOH і 0,2 мл біуретового реактиву) на СФ при 330 нм в кюветі з товщиною шару 1 см. екстинкція 0,30-0,60 приблизно відповідає вміст білка 2-4 мг в...
