відповідає змісту в сечі 4-аміноантипірину. p align="justify"> До профільтрувати гідролізату другої проби доливають 0,6 мл аміачного буфера, суміш перемішують і знову профільтровивают через паперовий фільтр. Відбирають в чисту пробірку 0,8 мл прозорого фільтрату і додають послідовно 0,2 мл дистильованої води, 2 мл розчину фенолу і 0,1 мл розчину гексаціаноферрата (III) калію. p align="justify"> Вміст пробірки перемішують і через 10 хв (але не пізніше ніж через годину) вимірюють екстинкцію другої дослідної проби на ФЕК або на спектрофотометрі при тих же умовах, що і для першої проби. Отримане значення екстинкції (Е2) відповідає змісту в сечі суми метаболітів (4-аміноантипірину і N-ацетил-4-аміноантипірину). p align="justify"> Розрахунок. Зміст метаболітів амідопірину в сечі і показники активності ферментних систем печінки, що беруть участь у перетворенні ксенобіотиків, розраховують за калібрувальним графіком. Для його побудови в 5 пробірок вносять відповідно 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 і 0,4 мл стандартного розчину 4-аміноантипірину. Потім у кожній пробірці доводять загальний об'єм проби до 5 мл дистильованою водою і доливають у них по 1 мл аміачного буфера. Вміст перемішують, фільтрують, відбирають в інші пробірки по 0,6 мл фільтрату і обробляють його так, як і при визначенні вільного 4-аміноантипірину в сечі (перша дослідна проба). Отримані значення екстинкції відповідають концентрації 4-аміноантипірину 5, 10, 20, 30 і 40 мкг/л (приблизний калібрувальний графік зображений на рис. 13). p align="justify"> За Е1 знаходять загальну кількість виділеного 4-аміноантипірину, множачи вміст його в пробі на добовий об'єм сечі (в мл).
В
За Е2 визначають аналогічним чином суму метаболітів амідопірину, виділених за добу з сечею.
Відносну активність монооксигенази печінки розраховують у% від введеної кількості амідопірину за формулою
А100%
-----
В
де А - сума метаболітів, виділених із сечею за добу;
В - кількість введеного тварині амідопірину.
ацетилюється активність ферментних систем організму х (у%) знаходять за формулою
(Е2 - Е1) 100%
х = -------
Е1
де Е1 і Е2 - відповідні екстинкції досвідчених проб.
Оформлення роботи. Розрахувати відносну активність ферментних систем N-деметилювання і ацетилювання у досліджуваних тварин і зробити висновок про практичне значення даного тесту. p align="justify"> Практичне значення роботи. Грунтовне вивчення ферментів печінки, які здійснюють реакції гідроксилювання багатьох сполук і їх кон'югацію, відкриває можливості непрямої оцінки активності вивчення складу і співвідношення метаболітів різних ксенобіотиків, що надходять в організм. Демонстративність і відносна простота виконання дозволяють використати ці тести не тільки в експерименті, але і в клінічній практиці для виявлення ранніх порушень різних токсичних речовин, виробничих факторів і різних ліків на ферментативної системи гідроксилювання та ацетилювання ксенобіотиків в організмі. br/>
Робота 104. Визначення активності алкогольдегідрогенази в сироватці крові по Шкурскі та ін з доповненнями І.В. Бокого, М.С. Усатенко і В.Ф. Трюфанова
Реактиви. Пірофосфатной буфер, 0,1 М розчин, рН 8,5 *; n-нітрозодіметіланілін, 26 мкМ розчин *; н-бутанол, 0,25 М водний розчин НАД +, свіжоприготований розчин (3,3 мг НАД в 1 мл 0 , 25 М розчину бутанолу).
Обладнання. Піпетки на 0,1; 1 і 2 мл; скляні палички; секундомір; спектрофотометр. p align="justify"> Матеріал. Сироватка крові. p align="justify"> Метод заснований на здатності алкогольдегідрогенази (АДГ) каталізувати дві послідовні реакції НАД-залежне окислення бутанолу та відновлення n-нітрозодіметіланіліна за участю НАД? Н2, що утворився в ході першої реакції. При цьому n-нітрозодіметіланілін, що має в розчині інтенсивно жовте забарвлення, знебарвлюється. Про активність АДГ судять за швидкістю світлопоглинання барвника, яке реєструють на спектрофотометрі при 440 нм. p align="justify"> Хід визначення. Спектрофотометр готують до роботи, встановлюють робочу довжину хвилі на 440 нм і стрілку шкали відліку за допомогою рукоятки на В«нульВ» при закритій шторці. p align="justify"> У кювету спектрофотометра поміщають 2 мл розчину n-нітрозодіметіланіліна і 0,5 мл сироватки крові. Проти цієї кювети рукояткою В«щілинуВ» встановлюють шкалу відліку на 0,300, після чого реакцію запускають додаванням в кювету 0,1 мл розчину НАД в розчині бутанолу. Суміш швидко перемішують скляною паличкою. Реєструють зниження екстинкції інкубаційного середовища протягом 2 хв при 25? С.
Примітка. Визначення активності АДГ в кожному зразку сироватки проводять двічі,...
