у числі відповідні пептидним хромафорам, розташовані в тій спектральної області, де спостерігається сильне поглинання води. Використання D 2 Про замість Н 2 Про іноді допомагає обійти цю трудність, але не вирішує проблему повністю, оскільки повна заміна лабільних протонів білка на дейтерій часто пов'язана з втратою його нативної конформації.
Описуваний нижчою метод визначення вторинної структури білка заснований на використанні ІЧ-спектрів поглинання білків в Н 2 Про [8-10]. Проблема, пов'язана з їх вимірюванням, була вирішена авторами методу за допомогою досить складної процедури компенсації поглинання води і використання дуже вузьких осередків (З довжиною оптичного шляху близько 6-12 мкм). Оскільки всі вимірювання проводилися в Н 2 Про труднощів з підтриманням нативної конформації білків не виникало.
Коливальні смуги поглинання зазвичай породжуються переходами, які можна досить точно віднести до певних хімічних зв'язків. У разі білків найбільш цікавими є три інфрачервоні смуги, відповідні коливальним переходам в пептидному остові. Це смуги, пов'язані з розтягуванням зв'язку NH (близько 3300 см -1 ), розтягуванням зв'язку C = O (1640-1660 см -1 , смуга амід I) і деформацією зв'язку NH (1520-1550 см -1 , смуга амід II). Ці смуги досить легко зареєструвати, оскільки кожне пептидна ланка дає внесок в їх інтенсивність.
Освіта водневих зв'язків при формуванні вторинної структури білка приводить до зрушення енергії цих трьох пептидних коливань. Перші дві смуги, що відповідають валентним коливанням, зміщуються в область більш низьких енергій, оскільки наявність водневого зв'язку полегшує зміщення атома азоту амидной групи і атома кисню карбонільної групи в напрямку акцептора або донора протона відповідно. Смуга амід II зміщується в бік більш високих енергій, так як воднева зв'язок перешкоджає изгибанию зв'язку NH.
Вплив водневих зв'язків на смуги амід I і амід II у разі a-спіралі і b-структури виявляється різним, що дає можливість використовувати ІЧ-спектри для визначення вторинної структури білків. Нижче представлена ​​таблиця, суммирующая дані про вплив вторинної структури на положення смуг амід I і амід II. У ній наведені положення максимумів (n 0 ) і значення інтенсивності в максимумах (Е 0 ) для смуг амід I і амід II, усереднені по декількох модельним поліпептидам і фібрилярні білкам в Н 2 О [9]:
Тип вторинної
Амід I
Амід II
структури
n 0 , см -1
Е 0 , л В· моль -1 В· см -1
n 0 , см -1
Е 0 , л В· моль -1 В· см -1
a-спіраль
1647
700
1551
1520
310
80
b-структура
1695
1619
180
980
1533
1563
340
100
невпорядковані-
ная форма
1651
320
1550
210
Слід зазначити, що розщеплення смуг амід I і амід II відбувається за рахунок взаємопов'язаності коливань в окремих пептидних групах.
На малюнку 2.1.1 представлені ІЧ-спектри трьох модельних поліпептидів, перебувають у конформаціях a-спіралі, b-структури і невпорядкованою форми.
2.2 Методи аналізу ІЧ-спектрів білків
У цілому, проблеми, які вирішуються при аналізі ІЧ-спектрів білків з метою визначення їх вторинної структури, дуже схожі з проблемами, що виникають при аналізі спектрів кругового дихроїзму білків. При цьому також використовується набір ІЧ-спектрів білків з відомою вторинною структурою, що використовуються в якості базисних. Так, наприклад, у методі, описаному у роботах [8-10], аналіз базисного набору, що складається з 13 спектрів глобулярних білків і 6 спектрів фібрилярних білків і поліпептидів в Н 2 О в діапазоні 1800-1480 см -1 , здійснюється за допомогою методів "регуляризації" [4] і "ортогональних спектрів" [6], розглянутих вище.
Автори цього методу вводять додаткову процедуру, що дозволяє виключити внесок в ІЧ-спектр білка поглинання б...
