доводячи сумарну концентрацію ліпідів (холестерину і МГДГ) до 2 мг, після чого ліпідну суспензію озвучували ультрозвуковое дезінтеграторах «УЗДН 2Т» (Росія) протягом 5 хвилин. Отримані даною процедурою препарати являють собою водну суспензію ліпід-сапонінових комплексів, стабільну при температурі (- 4? С) більше трьох місяців.
Утворені ліпід-сапонінових комплекси оцінювали електронно-мікроскопічно при збільшенні X50000 як описано раннє (Лі і співавт., 2004). Залежно від електронно-мікроскопічної картини утворюються структури поділяли на тубуляро-іскомальние (ТІ) комплекси, тубулярної-ліпосомальні (ТЛ) комплекси, класичні позовом і позовом, модифіковані заміною фосфолипида на МГДГ (шуканий-МГДГ).
В якості об'єктів порівняння при вивченні імуноад'ювантну властивостей ТІ-комплексу використовували ліпідні носії, здатні переносити антиген і забезпечувати ад'ювантний ефект: ПАФ, класичні позовом (на основі сапоніну QuilA, холестерину і фосфатидилхоліну у співвідношенні QuilA: Хол: ФГ=3: 2: 6), шукана, модифіковані заміною ФГ на МГДГ в еквівалентних кількостях (шуканий-МГДГ), а також позовом, модифіковані заміною тільки QuillA на КД у співвідношенні КД: Хол: ФГ=3: 2: 6 (морфологічно охарактеризовані як тубулярної-ліпосомальні (ТЛ) комплекси).
В якості модельного антигену використовували термічно оброблену, гідрофобну, мономірним форму пороутворюючих білка зовнішньої мембрани збудника псевдотуберкульозу Yersinia pseudotuberculosis з молекулярною масою близько 36 кД.
Зразки сироватки були проаналізовані на вміст антитіл методом ELSA (імуноферментний метод). Аналіз проводився на полістиролових мікропланшетках. Лунки покривалися поріновие білком як антигени в концентрації 10 мг/л. Антиген розводили в буферному розчині натрію бікарбонату pH 9,6 і 100 мкл розчину додавали в лунки планшета, інкубували 2:00 при 37 ° С.
Планшет відмивали в фосфатно-буферному розчині pH 7,4, що містить 0,05% за об'ємом Tween 20 (детергент) і висушували. Щоб запобігти неспецифічне зв'язування: 200 мкг фосфатного буфера з 0,05% Tween 20 додавали в лунки, планшети залишали на ніч при 4 ° С.. Потім відмивалися три рази і висушувалися. 100 мкл аліквоти (стандартний об'єм) мишачих сироваток кожного досвідченого зразка попередньо розводили від 1: 200 до 1: 320 буфером, примушували, додавали в лунки і інкубували 2:00 при 37 ° С. Контролем служила сироватка не імунізованих мишей. Планшети відмивалися як зазначалося вище, висушували і додавали 100 мкл аліквоти міченого пероксидазою антімишінного Ig (M + G) розведеного 1: 1000 в контактному буфері. Планшети инкубировались 1:00 при 37 ° С, відмивали і висушувалися. 100 мкл субстрату (тетраметилбензидину (ТМБ)) додавали в лунки і витримували в темряві при кімнатній температурі 20 хвилин. Ферментну реакцію зупиняли додаванням 50 мкл 1 Н Н2SО4. Активність специфічних антитіл визначалася фотометрією на багатоканальному спектрофотометрі при довжині хвилі 492 нм. Сироватка не імунізованих мишей використовувалася як негативний контроль.
порінов-містять ТІ-комплекси отримували з КД, холестерину і МГДГ, взятих у ваговому співвідношенні 3: 2: 6, з подальшим додаванням поріновие білка в необхідної концентрації в ФСБ (рН 7,2) в дозах , відповідних 0,1-1-10 мкг білка на 1 мкг змісту КД, а саме: 75 мкг, 750 мкг або 7500 мкг на 1 мл отриманої суміші. Отриману суміш озвучували ультразвуковим дезінтеграторах протягом 5 хв і залишали на 3:00. Мономерний поріновие білок з Y. pseudotuberculosis мимовільно включається в ТІ-комплекс. Отриманий препарат являє собою водну суспензію порінов-ліпід-сапонінових комплексів, стабільну при температурі (- 4оС) більше трьох місяців. Справжність препарату визначається якісним і кількісним складом вихідних структурних компонентів (КД, холестерину і МГДГ). Для оцінки зв'язування порінов з ТІ-комплексом проводили ультрацентрифугирование при 540000 g протягом 45 хвилин. Зміст незв'язаного білка визначали в надосадової рідини методом Лоурі (Lowry et al., 1951). Кількість білка, включеного в ТІ-комплекс, становила не менше 95%.
Імунізацію мишей порінов виробляли в/б в дозах 0,01, 0,1, 1, 10, 20, 50 мкг/миша в обсязі 0,2 мл ФСБ. Порінов в тих же дозах вводили в складі ТІ-комплексів. Як групи контролю використовували порінов в суміші з ПАФ, у складі позовом, шуканий-МГДГ і ТЛ-комплексів. Мишей імунізували двічі: повторну імунізацію виробляли через 14 днів після першої. На 6-й день після другої імунізації мишам в подушечку однієї з лапок вводили роздільну дозу порінов в половинній дозі від іммунізуючої в обсязі 0,02 мл ФСБ. У контрлатеральную лапку вводили такий же обсяг ФСБ. Забій тварин здійснювали на 7-й день після другої імунізації, оцінюючи ІВ ГЗТ в%.
Зміст специфічних антіпорінових антитіл визначали в сироватці крові мишей методом імуноферментного анал...
