вуваний Taq-полімеразою для синтезу другий ланцюга ДНК;
Буфер - суміш різних компонентів у певній концентрації, що забезпечують оптимальні умови для реакції, а також стабільне значення pH;
Аналізований зразок - підготовлений до внесення в реакційну суміш препарат, що містить шукану ДНК, що служить мішенню для подальшого багаторазового копіювання. За відсутності ДНК-мішені специфічний продукт ампліфікації не утворюється.
Циклічний температурний режим.
Якщо в аналізованому зразку присутній шукана ДНК, то в процесі реакції ампліфікації з нею відбувається низка подій, забезпечуваних певними температурними циклами. Кожен цикл ампліфікації складається з трьох етапів, описаних нижче:
Денатурація. На першому етапі необхідно денатурувати ДНК, що знаходиться у зразку. Для цього реакційну суміш нагрівають до 92-95 ° С, в результаті чого дволанцюжкові молекули ДНК розплітаються з утворенням двох одноланцюгових молекул.
Отжиг. На другому етапі праймери приєднуються до одноцепочечной ДНК-мішені. Цей процес носить назву «отжиг» («Annealing»). Праймери вибирають так, що вони обмежують шуканий фрагмент і комплементарні протилежним ланцюгах ДНК. Отжиг відбувається згідно з правилом комплементарності Чаргаффа. Якщо це правило не дотримане, то відпалу праймерів не відбувається.
Елонгація (синтез). На третьому етапі температуру в реакційній суміші доводять до оптимуму роботи Taq-полімерази (72 ° С), і синтез дочірньої ланцюга триває з максимальною ефективністю.
Надалі етапи денатурації, відпалу та елонгації багаторазово повторюються (30 і більше разів). На кожному циклі кількість синтезованих копій фрагмента ДНК подвоюється.
Результатом циклічного синтезу є експоненціальне збільшення кількості специфічного фрагмента ДНК. Фактично ж значення ефективності окремих циклів ампліфікації становить 78-97%. У разі присутності в пробі інгібіторів реакції це значення може бути набагато менше. Специфічні фрагменти, обмежені на кінцях праймерами, вперше з'являються в кінці другого циклу, накопичуються в геометричній прогресії і дуже скоро починають домінувати серед продуктів ампліфікації.
1.2.2 Автоматичне секвенування ДНК з флуоресцентною міткою
Автоматичне секвенування за допомогою флуоресцентно мічених дідезоксітермінаторов є останнім досягненням в області PCR-секвенування ДНК на сьогоднішній день. У 1986 році Худ з співавторами запропонували метод секвенування ДНК, в якому радіоактивне мічення, авторадіографія і візуальне читання нуклеотидів були замінені, відповідно, на флуоресцентні мітки, читання нуклеотидів за допомогою лазера, що індукує ці мітки і комп'ютерну обробку даних (Smith et al., 1986 ; Hood et al., 1987). Запропонований метод полягав у тому, що до секвеніруют праймеру приєднували одну з чотирьох флуоресцентних міток і запускали в реакцію з певним типом дидезоксинуклеотидтрифосфатами (ддНТФ) і рештою дезоксинуклеотидтрифосфатами (дНТФ). Одночасно проводилося чотири таких реакції з кожним з ддНТФ і праймером, несучим одну з чотирьох флуоресцентних міток. Після цього продукти реакцій поділялися в поліакриламідному гелі високого дозволу. На шляху міграції мічених фрагментів розташовувався чотириколірний лазерний детектор, який індукував кожну з м...
