.
Афінна хроматографія заснована на принципі виборчого взаємодії білків (або інших молекул) з закріпленими на носії специфічними речовинами - лігандами, якими можуть бути субстрати або коферменти (якщо виділяється небудь фермент) і т.д. Завдяки високій специфічності білків до ІММОБІЛІЗОВАНИХ (закріпленому) ліганду, до нього приєднується тільки один небудь білок з суміші. Зняття з колонки цього білка здійснюється підібраними спеціальними елюентом.
У гель-хроматографії в якості стаціонарної фази використовують гель у вигляді крихітних гранул, так що таку стаціонарну фазу можна розглядати як молекулярні сита. Гранули гелю виготовлені з полімеру зі зшитою структурою, подібної ситу. В якості такого полімерного матеріалу використовуються або зшита агароза, або декстран (полісахарид), або зшитий поліакриламід. У водному середовищі полімерний матеріал сорбує воду і набухає, перетворюючись на гелеподібної гранули, що зберігають пористу структуру, причому розмір пор такого набряклого матеріалу визначається ступенем зшивання полімеру. Нанесені на колонку з'єднання (у вигляді розчину в рухомій фазі) починають взаємодіяти з гранулами гелю, проникаючи в обсяг гранул через пори, що уповільнює рух розчиненої речовини по колонці. Молекули невеликого розміру краще затримуватися на колонці, оскільки легше проникають в об'єм гранул і розподіляються там. Молекули з розмірами, більшими, ніж розміри пір, зовсім будуть проникати всередину гранул, вони першими вимиваються з колонки.
Результати хроматографічного розділення представляються графічно у вигляді залежності вимірюваного властивості (поглинання в УФ області і т.п.) від обсягу елюата, вийшло з колонки. Піки на такому графіку відповідають виходу індивідуальних білків. Якщо при поділі виходить тільки один пік, це вказує на чистоту вихідного препарату, нанесеного на колонку.
Властивість білків набувати певної величини заряд при даному значенні рН розчину знайшло широке застосування для їх поділу методом електрофорезу. Електрофорез заснований на пересуванні зарядженої частинки в електричному полі. Рух її відбувається в рідкому середовищі, яка утримується інертним твердим носієм, наприклад, смужкою паперу, гелевою плівкою з крохмалю, поліакриламіду, декстрона і т.д.
При постійній напрузі рух зарядженої молекули білка визначається ставленням заряду до її розміром:
m = | (Q/r)
де Q-сумарний заряд білкової молекули;
r-радіус молекули.
З збільшенням цього відношення рухливість молекули зростає. Так як кожен білок має свою певну величину Q/r, швидкість переміщення різних білків в електричному полі буде різною. Електрофорез використовується для розділення білків і визначення їх молекулярних мас.
Застосування в певній послідовності вище перерахованих методів дозволяє отримати білок в очищеному стані, не позбавлений, однак, деяких домішок солей. Для повного очищення білків від низькомолекулярних домішок використовуються методи діалізу, кристалізації, гельхроматографіі та ультрафільтрації.
Є Чи отриманий білковий препарат індивідуальним білком або сумішшю має важливе значення. Завжди можна очікувати, що у складі ізольованого білка є домішка інших білків; це може призвести до неправильних висновків про властивості досліджуваного білка. Тому велика увага приділяється оцінці гомогенності - однорідності білків. Критерієм чистоти білків служать наступні показники: отримання білка в кристалічному стані; подальша неразделяемость при електрофорезі і ультрацентріфугірованіі; незалежність розчинності від кількості твердої фази; сталість амінокислотного складу; певний молекулярна вага; для багатьох білків - сталість специфічних біологічних властивостей (ферментативна активність, гормональна активність тощо)
1.11 Класифікація білків
Білки в Залежно від хімічної будови ділять на прості і складні. Прості білки при гідролізі розпадаються тільки на амінокислоти. При гідролізі складних білків поряд з амінокислотами утворюється речовина небілкової природи - простетическая група. Класифікація простих білків заснована на їх розчинності. p> Альбуміни - Водорозчинні білки з високою гідрофільністю, випадають в осад при 100%-му насиченні сульфатом амонію. До цих білків відносяться білок курячого яйця, білки зародка насіння злакових і бобових культур. Альбумін пшениці називають лейкозін, гороху - легумелін. Альбуміни містять всі незамінні амінокислоти.
Глобуліни - Розчиняються в сольових розчинах, найчастіше для вилучення глобулінів використовують 2 -10%-ий розчин хлориду натрію. Вони осідають 50%-им розчином сульфату амонію. Білки насіння бобових і олійних культур в основному представлені глобулінами; легумін - гороху та сочевиці, фазеолина - квасолі; гліцин - соєвих бобів. Багато альбуміни і глобуліни володіють ферментативним дією.
Проламіни. Ця група білків характерна виключно для насіння злаків. Ці білки розчиняються в 60...
