у. p align="justify"> Фотонефелометріческіе методи визначення вмісту білка грунтуються на оцінці ступеня каламутності його суспензії в розчинах. Ці методи не набули широкого поширення. p align="justify"> Спектрофотометричні методи діляться на прямі і непрямі. Останні являють собою боле чутливий і точний варіант фотоколориметричного. Після проведення кольорової реакції на білки проводять спектрофотометрію забарвленого розчину і по светопоглощению його в монохроматичному світлі розраховують вміст білка. p align="justify"> Прямий метод полягає у вимірюванні світлопоглинання розчину білка в ультрафіолетовій області при 200-220 нм (у цій області абсорбують пептидні групи білка) і при 280 нм (зона поглинання ароматичних радикалів амінокислот, в основному триптофану і тирозину) .
Ці методи дуже зручні і не вимагають попереднього утворення забарвлених комплексів.
Більш специфічна спектрофотометрія при 200-220 нм, ніж при 280 нм, так як в останньому випадку заважає светопоглощение різних низькомолекулярних ароматичних сполук, що містяться в біологічному матеріалі.
Робота 8. Кількісне визначення білка в сироватці крові
Реактиви. Біуретового реактив *; хлорид натрію, 0,9%-ний розчин. p align="justify"> Обладнання. Мікропіпетки і піпетки місткістю 1 і 5 мл; штатив із пробірками; скляні палички; фотоелектроколориметр (ФЕК); спектрофотометр (СФ). p align="justify"> Матеріали. Сироватка крові; альбумін, 10%-ний розчин. p align="justify"> а. Біуретового метод визначення вмісту білка в сироватці крові. p align="justify"> Метод заснований на здатності пептидних зв'язків білків і поліпептидів утворювати з іонами Cu2 + у лужному середовищі комплексне з'єднання фіолетового кольору, інтенсивність забарвлення якого пропорційна вмісту білка в середовищі.
Хід визначення.
Для визначення вмісту білка в сироватці крові або в інших об'єктах, що містять білок, необхідно побудувати калібрувальний графік.
Для цього застосовують стандартний білок - кристалічний альбумін сироватки крові.
Схема розведення альбуміну для побудови калібрувального графіка наведена в таблиці
№ пробіркіСтандартний 10%-ний розчин альбуміну, мл0, 9%-ний розчин хлориду натрію, млКонцентрація білка, г/лЕкстінкція10 ,40,64020,60,46030,80,28041,0-100
З кожної пробірки з розведеним стандартним розчином альбуміну беруть по 0,1 мл розчину і додають по 5 мл біуретового реактиву. Вміст змішують струшуванням. p align="justify"> Через 30 хв вимірюють екстинкцію кожної проби на ФЕК проти контрольного розчину (0,1 мл 0,9%-ного розчину NaCl + 5,0 мл біуретового реактиву) в кюветі товщиною 1 см, довжина хвилі 540 -560 нм (світлофільтр зелений).
За отриманими даними будують калибровочную криву, відкладаючи по осі ординат значення екстинкції, по осі абсцис - концентрацію білка.
Беруть 2 пробірки - в одну наливають 0,1 мл досліджуваної сироватки, в іншу (контрольну) - 0,1 мл розчину хлориду натрію. В обидві пробірки додають по 5 мл біуретового реактиву. Вміст змішують струшуванням. p align="justify"> Через 30 хв вимірюють екстинкцію досліджуваного розчину на ФЕК у кюветі товщиною 1 см при довжині хвилі 540-560 нм (зелений світлофільтр) проти контрольного розчину.
Вміст білка в сироватці крові знаходять по калібрувальної кривої.
б. Спектрофотометричний метод визначення вмісту білка в сироватці крові. Метод заснований на Світлопоглинання при 280 нм ароматичних радикалів тирозину, триптофану і меншою мірою фенілаланіну, що містяться в білку. Однак при даній довжині хвилі поглинають і нуклеїнові кислоти, хоча їх максимум абсорбції припадає на 260 нм. Тому вимірювання екстинкції розчину проводять при 260 і 280 нм, щоб зробити поправку на домішка нуклеїнових кислот і нуклеотидів. Метод непридатний до матеріалу, де вміст нуклеїнової кислоти перевищує 20%. p align="justify"> Хід визначення. У пробірку вносять 0,1 мл сироватки крові і додають 9,9 мл розчину хлориду натрію. Вміст перемішують скляною паличкою. p align="justify"> Вимірюють екстинкцію досліджуваного розчину проти контрольного розчину хлориду натрію на спектрофотометрі в кюветі товщиною 1 см при двох довжинах хвиль - 260 і 280 нм.
Розрахунок можна проводити за формулою, емпірично отриманої Калькаром (тому можна не вдаватися до калібрувальним графіком):
х = 1,45 Е280 - 0,74 Е260,
де х - концентрація білка в розчині, г/л.
Оформлення роботи. За калібрувальної кривої розрахувати вміст білка. Порівняти результати, отримані біуретовим методом і спектрофотометрическим. Зробити висновок про наявність відхилення концентрації білка в дослідж...
