субстратів;
б) для виявлення присутності білка в різних біологічних екстрактах і рідинах і кількісного його аналізу (зокрема, якісне та кількісне визначення білка в сечі засноване на реакції денатурації білка азотною кислотою);
в) для зв'язування солей важких металів білком при лікуванні отруєнь або їх профілактиці на виробництві;
г) для знезараження відходів у санітарно практиці;
д) для дезінфекції шкіри і слизових покривів.
Робота 7. Дослідження висолювання білків (на прикладі білків сироватки крові)
Висолювання - процес осадження білків солями лужних і лужноземельних металів, який є оборотним і зберігає нативні властивості білків. Висолювання можна проводити не тільки солями лужних і лужноземельних металів (Na2SO4, NaCl, KCl, MgSO4, MgCl2 та ін), але і нейтральними солями, наприклад (NH4) 2SO4. Всі речовини цього типу нейтралізують заряд білкових частинок і викликають їх дегідратацію, що веде до осадження білка. При розчиненні обложеного білка у воді відбувається відновлення його вихідних фізико-хімічних і біологічних властивостей. p align="justify"> Білки відрізняються один від одного зарядом і гідрофільністю, тому можна розділити білки, використовуючи для їх осадження різні концентрації солей або органічних розчинників в середовищі.
Реактиви. Сульфат амонію, насичений розчин; сульфат амонію, кристалічний, тонко подрібнений; біуретового реактив *. p align="justify"> Обладнання. Штатив із пробірками; піпетки; воронки для фільтрування; паперові фільтри. p align="justify"> Матеріал. Сироватка крові. p align="justify"> Метод заснований на здатності сульфату амонію нейтралізовувати заряд молекул білків і викликати їх дегідратацію, що призводить до осадження білка (висолювання); при напівнасичення осідають глобуліни, а при повному насиченні - альбуміни сироватки крові. Це пов'язано з тим, що глобуліни менш гідрофільних і мають велику молекулярну масу, ніж альбуміни. p align="justify"> Хід визначення. У пробірку вносять 20 крапель сироватки крові і додають рівний об'єм насиченого розчину сульфату амонію (виходить напівнасичення розчин). Випадає осад глобулінів. Через 5 хв осад відфільтровують. p align="justify"> До фільтрату додають тонко подрібнений порошок сульфату амонію до тих пір, поки він не перестає розчинятися (повне насичення). Випадає осад альбумінів. Осад відфільтровують. Фільтрат перевіряють на відсутність білка, проробляючи біуретову реакцію (див. роботу 1). p align="justify"> Оформлення роботи. Результати оформити у вигляді таблиці
висаліваются веществоСтепень насичення розчину сульфатом аммоніяОсаждаемая фракція білків сироватки крові
У висновку вказати на можливість розділення білків методом висолювання, принцип його і відмінності від осадження шляхом денатурації.
Практичне значення роботи. Метод висолювання використовують у клінічних лабораторіях для розділення альбумінів і глобулінів і визначення їх співвідношення в сироватці крові. Обложену фракцію білка можна відокремити центрифугуванням, розчинити і кількісно визначити вміст її за допомогою різних методів. У нормі співвідношення альбумін/глобулін в сироватці крові людини коливається в межах 1,5-2,3 і може змінюватися при патології, наприклад, при запальних захворюваннях, коли збільшується вміст глобулінів. p align="justify"> Висолювання застосовують також для очищення та отримання кристалічних препаратів білків.
. Кількісний аналіз білків
Для кількісного визначення білків в біологічному матеріалі або лікарських препаратах найчастіше вживаються азотометрія, фотоколориметрія, фотонефелометрія і спектрофотометрія.
Азотометрія заснована на визначенні вмісту азоту білка після мінералізації досліджуваного зразка. Оскільки білки містять в середньому 16% азоту, то знайдену кількість його помножити на 6,25 (так як 100:16 = 6,25) і отримують вміст білка в пробі. Ці методи (до них відноситься класичний метод Кьельдаля і його модифікації) дуже трудомісткі і не завжди надійні, так як процентний вміст азоту в різних білках коливається від 14 до 19. p align="justify"> Фотоколориметричні методи засновані на так званих В«кольоровихВ» реакціях на функціональні групи білків. Серед них найбільше застосування знайшли биуретовая реакція на пептидні групи і реакція Фоліна на ароматичні радикали амінокислот (тирозин, триптофан). Біуретового метод більш специфічний, так як пептидні зв'язку маються тільки в білках і пептидах. Він широко застосовується в клініко-біохімічних дослідженнях. Метод Лоурі, заснований на реакції Фоліна, високочутливий, але малоспецифичними, оскільки подібну забарвлення дають вільні ароматичні амінокислоти і багато інших з'єднань, що містять фенольну груп...
