ну характеристику ампліфікованих ділянок геному з допомогою ряду методик.
За порівнянні з традиційними методами діагностики, генодіагностіка з використанням ампліфікаціонних технологій відрізняється високою чутливістю і дозволяє використовувати для діагностики зразки, в яких не міститься живих збудників, але тільки фрагменти їх генетичного матеріалу.
Результати генотипування характеризуються більшою однозначністю в порівнянні з морфологічними, біохімічними або імунологічними методами класифікації мікроорганізмів і надають безпосередню інформацію для з'ясування еволюційних і епідеміологічних зв'язків різних ізолятів бактерій.
Загальні відомості та принципи
Геномна ДНК збудників ГБМ являє собою досить велику кільцеву хромосому, так, наприклад, генома N.meningitidis складається з 2.3 мільйона пар основ і близько 2160 генів. Функції багатьох генів ще невідомі, однак серед них можна виділити унікальні ділянки, специфічні для даного роду, виду йди підвиду мікроорганізмів. Власне генодіагностіка і полягає в тому, щоб розмножити і впізнати подібну ділянку, що може бути зроблено за допомогою ПЛР.
Принцип ПЛР був описаний в 1986 р. В основі цього методу лежить багаторазове копіювання з допомогою ферменту ДНК-полімерази певного фрагмента ДНК.
Комплементарне добудовування ниток може початися не в будь-якій точці послідовності ДНК, а тільки в певних стартових блоках - коротких двунітевих ділянках. Для створення стартових блоків у заданих ділянках ДНК використовують затравки, представляють собою спеціально сінтезірованнние in vitro олігонуклеотиди довжиною близько 20 - 30 підстав, звані праймерами.
Праймери комплементарні послідовностям ДНК на лівій і правій межах ампліфіціруемого фрагмента і орієнтовані таким чином, що синтез ДНК, здійснюваний ДНК-полімеразою, протікає між ними. Процес ампліфікації полягає в повторенні циклів, що складаються з денатурації ДНК, відпалу праймерів і синтезу фрагмента ДНК, що проходять при різній температурі, і проводиться на приладі з програмним контролем температурного режиму - термоциклер. У результаті відбувається експоненціальне збільшення кількості копій специфічного фрагмента за формулою 2n, де n - число циклів ампліфікації. Після 30 - 35 циклів ампліфікації синтезується 108 копій фрагмента - амплікон, що робить можливим визначення та візуалізацію їх електрофоретичної рухливості в агарозному або акріламідном гелі. Праймери, що визначають специфічність ПЛР, можуть бути строго видоспецифічними або з допомогою можна виявити цілі роди мікроорганізмів.
В
Показання до застосування методу
Показання до застосування нового методу починаються там, де виникають протипоказання до застосуванню класичних методів. Ідентифікація патогена шляхом мікробіологічного культивування із зразків спинномозкової рідини або крові хворого, залишаючись "золотим стандартом" діагностики, має серйозні обмеження, обумовлені застосуванням антибіотиків на догоспітальному етапі. Згідно з Наказом № 375 МОЗ РФ "... на дому слід ввести разову дозу пеніциліну, а при тяжкій менінгококцемія переважно введення левоміцетину-сукцинату ". Подібна практика покращує прогноз захворювання, але різко знижує число зразків СМР, придатних для мікробіологічного і подальшого епідеміологічного аналізу.
У останні роки близько половини хворих ГБМ, що надходили до інфекційної клінічну лікарню отримували антибіотики на догоспітальному етапі; при цьому в групі хворих, які отримували антибіотики на дому, летальність була менше 5%, а культуру бактерій з СМЖ (або крові,) вдавалося отримати лише в 30 я% випадків; навпаки, в групі хворих, які не отримали антибіотики, летальність була вище +10%, А культуру бактерій отримували як мінімум в 60% случаев. Крім того, бактеріологічна діагностика займає не менше доби. Таким чином, ситуація вимагає розробки і застосування "некультуральних" методів ідентифікації збудників ГБМ.
Відомим "Некультуральним" методом виявлення антигенів збудників ГБМ є метод латекс-аглютинації (ЛА) із застосуванням відповідних комерційних тест-систем. Латексні частинки, покриті специфічними антитілами до антигенів Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae або Haemophilus influenzae, агглютинируют у присутності бактеріальних антигенів, що містяться в СМР; результат аглютинації оцінюється візуально. Постановка всієї реакції займає близько 10 хв, реакція не вимагає наявності живих бактерій в СМР. Однак чутливість методу ЛА порівняно невисока, близько 70%, що не дивно, оскільки мінімально обумовлена ​​концентрація бактерій в СМР методом ЛА складає від 10 5 до 5 * 10 6 бактерій/мл або від 1 до 50 нг антигену/мл. При цьому вартість тест-систем в перерахунку на одну діагностичну реакцію не менше $ 8.
Основні гідності ПЛР:
В· можливість виявлення навіть декількох копій генома бактерій у зразку і, як нас...
