агрегація білків беруть участь у генерації клітинної асиметрії під час споруляции (білки FstZ і SpoIIE). Не дивлячись на сходность локалізації під час споруляции, сигнали від FstZ-CFP і SpoIIE-YPF були чітко помітні один від одного. У той же час було показано, що природний білок DsRed малопридатний для мічення клітин B. subtilis .
Для характеристики продукту досліджуваного гена потрібні антитіла, за допомогою яких можна здійснити виявлення даного білка. Для отримання антитіл необхідно очистити досліджуваний білок і імунізувати ним тварину. Ця процедура тривала і дорога, а отримані антитіла часто різняться за своїми властивостями. Щоб обійти ці проблеми був створений набір векторів для пришивання до білків антигенних детермінант (реагує з антитілом частина антигену) (Kaltwasser et al., 2002): FLAG (штучно синтезований пептид), HA (Отримано з гемаглютиніну вірусу грипу) і c-Myc (отримано з протоонкогена c- myc людини) довжиною 8, 9 і 10 амінокислотних залишків відповідно. Антитіла, специфічно розпізнають ці антигенні детермінанти, є у продажу. <В
В В
Рис.12. Вектори для отримання гібридних білків. (A) Вектори для отримання білків зшитих з антигенними детермінантами. (B) Вектори для отримання білків злитих з флюоресцирующими білками. ori - реплікативний регіон плазміди ColE1; EmR і ApR, гени резистентності до еритроміцину і ампіциліну, відповідно; lacI - ген репрессора LacI; P spac - IPTG-залежний промотор; t1t2t0, термінатори (lt0; t1, t2 з rrnB ), trpA t, термінатор триптофанового оперона E. coli ; MCS, полілінкерамі; tag, послідовність, що кодує антигенну детермінанту (FLAG, cMyc або HA); FP, ген флуоресцентного білка (GFP +, CFP або YFP). br/>
На основі вектора pMUTIN2 (Vagner et al., 1998; див. вище) був сконструйований вектор pMUTIN-Ter (рис.12). На його основі, шляхом вставки послідовностей, що кодують відповідні антигенні детермінанти, були отримані вектори pMUTIN-FLAG,-cMyc і-HA. Для проведення злиття цікавить білка з цими антигенними детермінантами, 3 Вў-кінець гена (близько 300п.н.) вставляється безпосередньо перед послідовністю, що кодує антигенну детермінанту. Потрібний гібридний білок буде синтезуватися після інтеграції цілого вектора в хромосомального ген шляхом гомологичной рекомбінації. Якщо ген є частиною оперона, то транскрипція проксимальніше розташованих генів оперона забезпечується IPTG-залежним промотором. Антигенні детермінанти c-Myc і HA можуть бути також використані для очищення гібридних білків шляхом афінної хроматографії. p> Аналогічно на основі pMUTIN-Ter шляхом вставки послідовностей, що кодують відповідні флуорісцірующіе білки, були отримані вектори pMUTIN-GFP +,-CFP і-YFP (ріс.12b), що дозволяють виробляти злиття білків, кодованих хромосомального генами, з флуоресціюючими білками. Це дозволяє простежити локалізацію досліджуваного білка в клітині. Функціонування всіх шест...
