х грунтується їх поділ В
На яких фізико-хімічних особливостях білків можуть бути засновані способи їх поділу? По-перше, це розмір молекули, її геометрія. На використанні цієї особливості базуються методи гель-хроматографії та ультрафільтрації, почасти електрофорез в гелях.
друге, характерне для даного білка розподілення заряджених груп на його поверхні . Співвідношення катіонних і аніонних груп в білку змінюється в залежності від рН, ізоелектричної точки білків - pI (Значення рН, при якому позитивні і негативні заряди білка повністю компенсовані і сумарний заряд дорівнює нулю) істотно розрізняються у різних білків. Відомі білки, що є у фізіологічних умовах катіонними, аніонними або молекулами без помітного переважання того або іншого заряду. На розходженні заряду білків при різних рН грунтується їх поділ методами електрофорезу, ізоелектричного фокусування, ізоелектричної та іонообмінної хроматографії. Істотно, проте, не тільки співвідношення заряджених груп, визначальне значення pI. Білки з подібними ізоелектрична точками можуть відрізнятися розподілом заряджених функціональних груп по поверхні глобули. Останні розміщуються більш-менш рівномірно небудь; навпаки, утворюють локальні згущення, грона однаково заряджених груп, що позначається при ионнообменной хроматографії білка.
третє, білки розрізняються числом і характером гідрофобних ділянок поверхні, що використовують при гідрофобною хроматографії
Зауважимо, що жоден з розглянутих вище ознак не може сам по собі забезпечити виділення індивідуального білка зі складної суміші - вони недостатньо характеристичностью, не гарантують вибірковості очищення. Значно більш перспективно в цьому відношенні
використання для виділення функціональних властивостей білка. Дійсно, серед безлічі білків у вихідному матеріалі знайдеться чимало таких, які мають подібну молекулярну масу або близькі ізоелектричної точки, однак число, наприклад, фосфатаз або амилаз буде свідомо невеликим. Очевидно, що метод виділення, заснований на використанні здатності цих ферментів взаємодіяти зі своїм специфічним субстратом, незрівнянно виборчі, ніж будь-який прийом, який базується на різниці фізико-хімічних властивостей.
Схеми виділення білків, що використовують тільки один який-небудь принцип, рідкісні, зазвичай різні підходи до фракціонування поєднуються і доповнюють один одного.
Поділ білків за молекулярною масою. Гель-хроматографія (Гель-фільтрація)
В
У цьому методі використовують гранульовані гелі поперечно-зшитих гідрофільних матеріалів, наприклад декстрану (сефадексе, сефароза та їх аналоги), поліакриламіду (біогелі та їх аналоги), полівінілового спирту (тойоперл). Гранули утворені тривимірної сіткою полімеру, яка непроникна для великих молекул, частково проникна для молекул проміжного розміру і добре проникна для невеликих молекул, солей і води. Залежно від середнього розміру осередку полімерного гелю і геометрії молекули останньої доступна більша або менша частина загального обсягу гранул гелю.
При русі розчину, що містить білки та інші молекули, по колонці, яка заповнена набряклими гранулами гелю, компоненти суміші, проникли в гель, затримуються в ньому. Таким чином, вони відстають від більш великих молекул, які не можуть увійти всередину гранул і знаходяться тільки в омиває їх розчині. Не будучи включеними в гель, великі молекули з'являються в елюаті, як тільки через колонку пройде "вільний" об'єм розчину , Що дорівнює об'єму розчину, укладеним між гранулами гелю. Останній визначається щільністю упаковки і геометрією гранул. Для сферичних частинок, у вигляді яких зазвичай і випускаються матеріали для гель-хроматографії, вільний об'єм становить 30-35% загального обсягу колонки.
Якщо розміри молекул білка такі, що вони можуть проникати в пори, складові певну частину обсягу гранул, то буде спостерігатися затримка елюції і білок з'явиться в обсязі V e , пов'язаному з коефіцієнтом доступності (часток обсягу гранул, доступною даному виду молекул) співвідношенням:
В
де V, - повний обсяг колонки, за вирахуванням тієї його частини, яка припадає на сам гель утворює полімер.
Кожному білку в залежності від розмірів його молекули відповідає своє значення, на чому і заснувало поділ при гель-хроматографії. Зрозуміло, що якщо обсяг елюції близький до вільного об'єму, то прагне до нуля і розділення білків, молекули яких практично не входять в пори гелю, не відбудеться. Точно так само молекули невеликих розмірів, для яких проникний весь обсяг гелю (V e близький до і прагне до одиниці), в гелі з даними характеристиками продукції розділяться. Найкраще дозвіл виходить, якщо знаходиться в межах 0,4 - 0,6. Зрозуміло, межі поділу можна розширити, використовуючи для високомолекулярних білків великопористі, а для невеликих - дрібнопористі гелі.
Строго кажучи, при гель-хроматографії по...
