діл білків визначається НЕ молекулярною масою, а геометричними розмірами молекули. Відповідно, молекули витягнутої форми за рахунок "кувиркання" в розчині важче проникають в гелі, ніж сферичні молекули такої молекулярної маси. Цим пояснюється рання елюція денатурованих білків, які ведуть себе як невпорядкований пухкий клубок, а не як компактна глобула.
Проста залежність між обсягом елюції і молекулярною масою білка (справедлива, звичайно, тільки для компактних сферичних молекул) і легкість експерименту зробили гель-хроматографію улюбленим методом визначення молекулярної маси білків. Для цієї мети колонку, заповнену відповідним гелем, калібрують набором білків з відомими молекулярними масами, після чого визначають обсяг елюції досліджуваного білка і обчислюють його молекулярну масу інтерполяцією. Точність методу не дуже велика, але цілком достатня для більшості практично зустрічаються завдань.
В
При використанні даного методу необхідно враховувати обмеження, виникають через те, що гель, який утворює матеріал не цілком інертний, як це передбачає теорія методу, і може взаємодіяти з речовинами, що розділяються, що спотворює залежність обсягу елюції від розміру молекули. Це особливо позначається при поділі малих кількостей білка, так як сорбційна ємність матриці гелю невелика і у великомасштабних дослідах її взаємодія з білком мало відбивається на процесі.
Зв'язування білків гельобразующімі матеріалами може бути викликано іонообмінними взаємодіями, зокрема вмістом негативно заряджених груп у полісахаридних матрицях (сефароза, сефадексе), а також у поліакриламідних матеріалах. В останніх карбоксильні групи виникають при спонтанному гідролізі амідів, в полісахаридах ж вони можуть утворюватися в результаті окислення. Затримка при гель-хроматографії, викликана іонообмінними взаємодіями з матрицею, особливо характерна для катіонних білків, наприклад лізоциму та деяких субтілізін. Нерідко вона дуже значна і може навіть перешкоджати відділенню солей від білка. В аналітичних дослідах таке утримування вдається придушити значним підвищенням іонної сили розчину.
Ще одна причина аномального утримування речовин при гель-хроматографії, особливо помітна при виділенні невеликих молекул, наприклад пептидів. - Гідрофобна зв'язування з матрицею гелю. p> Гідрофобні елементи включаються в гідрофільні полісахаридні матриці при обробці їх зшиваючими агентами, зокрема епі-хлоргідрин, при синтезі сефадексе. Пептиди, що містять гідрофобні, в особливості ароматичні, залишки (фенілалаііна, триптофану) іноді утримуються матрицею настільки значно, що з'являються в елюаті пізніше неорганічних солей.
Роздільна здатність методу не дуже велика, в той же час простота проведення і м'якість умов експерименту є його безперечними перевагами. Застосовність методу на перших етапах очищення обмежується тим, що для задовільного фракціонування білків обсяг завдається розчину не повинен перевищувати
3-5% загального обсягу колонки. Зважаючи на це до гель-хроматографії зазвичай вдаються в середині або на завершальних етапах виділення білка. Зрозуміло, при відділенні низькомолекулярних домішок, зокрема при знесолюванні, обсяг зразка може бути значно більшим, оскільки не потрібно високого дозволу. У такому спрощеному варіанті гель-фільтрацію використовують особливо часто.
Незважаючи на зазначені обмеження, гель-хроматографія - зручний спосіб фракціонування білків. Його застосовують і для відділення від білків низькомолекулярних домішок, у тому числі солей.
Останнім часом поряд з гельобразующімі матеріалами для розділення білків за розмірами почали застосовувати макропористі неорганічні носії - Макропористі скло і силікагель. Зазвичай поверхню цих матеріалів покривають гідрофільними органічними речовинами, щоб виключити необоротну сорбцію білків. Жорсткість цих матеріалів дозволяє розділяти білки за розміром молекул при підвищених тисках, що прискорює процес і знижує перешкоди з боку дифузії.
Ионообменная хроматографія білків
В
Метод іонообмінної хроматографії, заснований на відмінностях у співвідношенні і розподілі заряджених груп на поверхні білка, належить до числа найбільш використовуваних. У хроматографії білків практично не застосовують синтетичні іонообмінні смоли на основі полістиролу, вельми популярні в аналітичної хімії амінокислот і пептидів. Це пояснюється, по-перше, великим вмістом поперечних зшивок, що роблять матеріали такого роду практично непроникними для білків, по-друге, сорбцией білків, часом необоротною, на гідрофобною поверхні полістиролу. p> За вказаними міркувань для розділення білків використовують іонообмінники, в яких матриця ("підкладка") виразно гідрофільна . Особливо поширені іонообмінники, одержувані приєднанням монотонних груп до целюлози, поперечно-зшитим декстранами (сефадексе).
Для отримання катіонів в якості ионогенной найчастіше використовують карбоксильну ...
