зводять у 0,96 мл ізотонічного розчину. У досвід беруть кількість антигену, рівну половині титру (0,5 мл). Це його робоча доза. Готують загальне розведення антигену для всього досвіду, множачи 0,5 мл на число пробірок в досвіді. p align="justify">. Антитіло - сироватка хворого. Свіжу сироватку перед досвідом інактивують, щоб зруйнувати наявний в ній комплемент. Для цього її прогрівають 30 хв при 56 В° С на водяній бані або в инактиваторов з терморегулятором. Останній спосіб переважніше: він виключає можливість перегріву
Постановка реакції зв'язування комплементу (РСК).
Реакцію ставлять в обсязі 1 куб. см (по 0,2 куб. см кожного компонента).
Піддослідні сироватки досліджують у розведенні 1: 5 і 1: 10 (доза сироватки 0,04 куб. см і 0,02 куб. см зі специфічним антигеном, в розведенні 1: 5 з контрольним антигеном (на специфічність) і без антигену (на антікомплементарние).
В
Піддослідні і контрольні сироватки інактивують на день постановки реакції в розведеному вигляді при 56-65 В° С (залежно від виду тварин) протягом 30 хв. (Також у РДСК). p align="justify"> Обидва етапи реакції проводять у водяній бані при 37-38 В° С, бактеріолітичну систему витримують 60 хв, другий етап реакції (з гемолітичною системою) - 20 хв.
В
Контролі головного досвіду РСК:
позитивна сироватка в розведенні 1: 5 без антигену і з контрольним антигеном; в розведеннях від 1: 5 до її титру зі специфічним антигеном;
негативна сироватка в розведеннях 1: 5 і 1: 10 із специфічним антигеном, в розведенні 1: 5 з контрольним антигеном і без антигену - антигени специфічний і контрольний в подвійній дозі - на антікомплементарние (комплемент +) і на гемотоксічность (комплемент);
гемолітична система на гемотоксічность (комплемент).
Облік результатів. У контролях не повинно бути навіть слідів гемолізу, так як в одному з них немає комплементу, в іншому - гемолизина. Контролі свідчать про відсутність у компонентів реакції гемотоксічності (здатності спонтанно лизировать еритроцити). p align="justify"> У досвіді активність комплементу може знизитися за рахунок неспецифічної адсорбції його іншими компонентами реакції, тому для досвіду кількість комплементу збільшують: беруть наступну за титром дозу. Це - робоча доза. p align="justify"> Існують різні варіанти постановки РСК: класичні. метод постановки у вигляді макро - і мікроваріант, реакція тривалого зв'язування комплементу (РДСК) на холоді, метод кількостей. РСК по 50%-ному гемолизу сенсибілізованих еритроцитів і ін Для діагностики ряду захворювань застосовують більш чутливий метод - РДСК. p align="justify"> Постановка реакції тривалого зв'язування комплементу (РДСК).
Першу фазу реакції проводять у холодильнику при 2-6 В° С протягом 16-18 год., другу фазу у водяній бані 20 хв при 37-38 В° С.
Комплемент застосовують у робочому розведенні 1: 25 або 1: 30 (при визначенні його робочого розведення).
У перший день розливають сироватки та антиген для головного досвіду. Реакцію ставлять в обсязі 1 куб. см (по 0,2 куб. см кожного компонента). Контролі РДСК такі ж як при постановці РЗК. p align="justify"> Потім в усі пробірки головного досвіду і відповідних контролів розливають комплемент по 0,2 куб. см залежно від його робочого розведення, пробірки струшують і поміщають в холодильник на 16-18 год. при 2-6 В° С.
Наступного дня штативи з першою фазою виймають з холодильника і після витримування протягом 20-30 хв. при кімнатній температурі в усі пробірки розливають гемолітичну систему в дозі (у наведеному прикладі - 0,6 куб. см). Штативи струшують і поміщають у водяну баню на 20 хв. при 37-38 В° С.
Схема головного досвіду РДСК представлена ​​в таблиці 3.
В
Облік результатів РСК, РДСК проводять двічі: перший раз - відразу після водяної бані, другий - після осідання еритроцитів на дно пробірки (через 3-4 години після водяній лазні) або на наступний день при зберіганні в холодильнику від 2 В° до 6 В° С.
Для об'єктивного визначення результатів реакції оцінку рекомендується проводити у відсотках гемолізу. Для цього з реакції вибирають 5 пробірок з повним (100%) гемолізом і рідина з них зливають в одну пробірку. З неї готують розведення з меншим відсотком гемолізу так звану "Стандартну" шкалу. p align="justify"> Ступінь гемолізу в пробірках з досліджуваними сироватками визначають шляхом порівняння зі ступенем гемолізу в "стандартних" пробірках і відсоток гемолізу висловлюють в хрестах.
Ступінь затримки обернено пропорційна відсотку гемолізу еритроцитів:
+ + + + (4 хрести) - відсутність гемолізу, надоса...
