и методами детекції [9].
ПЛР використовується в багатьох областях для проведення аналізів і в наукових експериментах.
Переваги методу ПЛР:
для аналізу методом ПЛР придатний абсолютно будь-який біологічний матеріал;
специфічність ПЛР дорівнює 100% (при правильному виконанні ПЛР хибнопозитивний результат неможливий);
висока чутливість (ПЛР дозволяє виявити від декількох копій до одного збудника у зразку);
одночасно можна виявити кілька збудників в одному зразку;
динаміка чисельності збудника захворювання (ПЛР дозволяє визначати кількість копій збудника в зразку, що дозволяє оцінити ефективність проведеної терапії);
процес повністю автоматизований і результат ПЛР можна отримати через кілька годин після початку дослідження [8].
Недоліки методу ПЛР:
Незважаючи на вищевказані гідності метод ПЛР все ж не позбавлений деяких недоліків, які слід враховувати при оцінці результатів досліджень:
. амплифицируют ДНК як живого, так і загиблого мікроорганізму. Це накладає певні вимоги при використанні ПЛР для контролю ефективності лікування. У загальному випадку подібний контроль повинен проводитися через проміжок часу, напротязі якого відбувається повна елімінація збудника. Однак, метод NASBA виявляє РНК тільки живих мікроорганізмів і дозволяє уникнути цих обмежень.
. Висока чутливість. Ряд мікроорганізмів (умовно - патогенна флора, УПФ) в нормі може існувати у людини в малій кількості. За допомогою методу ПЛР визначаються навіть найменші кількості УПФ, навіть за відсутності патології. Однак ця проблема вирішена з появою методу кількісного визначення ДНК.
. Відмінності при використанні різних тест систем. Як говорилося вище, для ампліфікації можна використовувати різні ділянки геному збудника. Однак у випадку різних мутації мікроорганізмів можлива зміна або втрата генів. Це призводить до різних результатів при використанні тест систем різних виробників.
Контамінація - потрапляння із зовнішнього середовища в реакційну суміш специфічних молекул ДНК, здатних служити мішенями у реакції ампліфікації і давати хибнопозитивні результати [4].
. 3 Різновиди ПЛР
Вкладена ПЛР (Nested PCR (англ.)) - застосовується для зменшення числа побічних продуктів реакції. Використовують дві пари праймерів і проводять дві послідовні реакції. Друга пара праймерів амплифицируют ділянка ДНК всередині продукту першої реакції.
Інвертована ПЦР (Inverse PCR (англ.)) - використовується в тому випадку, якщо відомий лише невелику ділянку всередині потрібній послідовності. Цей метод особливо корисний, коли потрібно визначити сусідні послідовності після вставки ДНК в геном. Для здійснення інвертованою ПЛР проводять ряд розрізання ДНК рестриктазами з подальшим з'єднанням фрагментів (лігування). У результаті відомі фрагменти виявляються на обох кінцях невідомого ділянки, після чого можна проводити ПЛР як звичайно.
ПЛР зі зворотною транскрипцією (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) - використовується для ампліфікації, виділення або ідентифікації відомої послідовності з бібліотеки РНК. Перед звичайної ПЛР проводять на матриці мРНК синтез одноцепочечной молекули ДНК за допомогою ревертази і отримують одноцепочечную кДНК, яка використовується в якості матриці для ПЛР. Цим методом часто визначають, де і коли експресуються дані гени.
Асиметрична ПЛР (англ. Asymmetric PCR) - проводиться тоді, коли потрібно ампліфікувати переважно одну з ланцюгів вихідної ДНК. Використовується в деяких методиках секвенування і гибридизационного аналізу. ПЛР проводиться як звичайно, за винятком того, що один з праймерів береться у великому надлишку. [9].
Кількісна ПЛР (Quantitative PCR, Q-PCR (англ.) - використовується для безпосереднього спостереження за вимірюванням кількості конкретного ПЛР продукту в кожному циклі реакції. У цьому методі використовують флуоресцентно-мічені праймери або ДНК-зонди для точного вимірювання кількості продукту реакції у міру його накопичення.
Ступенева ПЦР (Touchdown PCR (англ.)) - за допомогою цього підходу зменшують вплив неспецифічного зв'язування праймерів. Перші цикли проводять при температурі вище оптимальної температури відпалу, потім кожні кілька циклів температуру відпалу поступово знижують до оптимальної. С.
Метод молекулярних колоній (ПЛР в гелі, англ. Colony - PCR Colony) - акріламідний гель полимеризуют зі всіма компонентами ПЛР на поверхні і проводять ПЛР. У точках, що містять аналізовану ДНК, відбувається ампліфікація з утворенням моле...
