кулярних колоній [3,7].
ПЛР довгих фрагментів (англ. Long-range PCR) - модифікація ПЛР для ампліфікації протяжних ділянок ДНК (10000 і більше підстав). Використовують суміш двох полимераз. (Англ. Random Amplification of Polymorphic DNA), ПЛР з випадковою амплификацией поліморфної ДНК - використовується тоді, коли потрібно розрізнити близькі по генетичній послідовності організми, наприклад, різні сорти культурних рослин, породи собак або близькоспоріднені мікроорганізми.
Групп-специфічна ПЛР (англ. group-specific PCR) - ПЛР для родинних послідовностях всередині одного або між різними видами, використовуючи консервативні праймери до цих послідовностям. Протилежний цьому методу є - унікальна ПЛР (англ. Unique PCR), в якому завдання полягає в підборі праймерів для ампліфікації тільки конкретної послідовності серед споріднених послідовностей.
ПЛР з використанням гарячого старту (англ. Hot-start PCR) - модифікація ПЛР з використанням ДНК-полімерази, в якій полімеразна активність блокується при кімнатній температурі антитілами або імітують антитіла невеликими молекулами типу Affibody, тобто в момент постановки реакції до першої денатурації в ПЛР. Зазвичай, перша денатурація проводиться при 95 ° C протягом 10 хвилин.
Віртуальна ПЛР (англ. in silico PCR, цифрова ПЛР, електронна ПЛР, е-ПЛР) - математичний метод комп'ютерного аналізу теоретичної полімеразної ланцюгової реакції c використанням списку послідовностей праймерів (або ДНК-зондів) для передбачення потенційної ампліфікації ДНК досліджуваного геному, хромосоми, кільцевої ДНК або будь-якого іншого ділянки ДНК.
ПЛР в реальному часі (або кількісна ПЛР, англ. Real-time PCR, qPCR, qRT-PCR) -Метод включає в себе одночасно детекцию і кількісне визначення (вимірювання безпосередньо кількості копій, або вимір копій щодо внесеної ДНК або додаткових калібрувальних генів) специфічної послідовності ДНК у зразку. Метод використовує загальні принципи ПЛР. Основна відмінність полягає в тому, що вимірюється кількість ампліфікованої ДНК в реальному часі після кожного циклу ампліфікації?? [11].
1.4 Mеханизм ПЛР. Стадії постановки ПЛР
Вся методика базується на здатності нуклеїнових кислот до самостійної реплікації, що в даному випадку проводиться штучно в умовах лабораторії. Відтворення ДНК може початися не в будь-якій області молекули, а тільки в ділянках з певною послідовністю нуклеотидів - стартових фрагментах. Для того щоб полімеразна ланцюгова реакція почалася, потрібні праймери (або ДНК-зонди). Для проведення полімеразної ланцюгової реакції необхідне дотримання ряду умов:
Наявність в реакційній суміші ряду компонентів:
Праймери - олигонуклеотид, що виконує роль затравки і ініціює синтез полінуклеотидних ланцюга на ДНК-або РНК-матриці. Правильно підібрані праймери забезпечують специфічність і чутливість тест-системи. полімераза - термостабільний фермент, що забезпечує добудовування 3-кінців другого ланцюга ДНК згідно з принципом комплементарності.
Суміш дезоксінуклеотідтріфосфатов (дНТФ) - дезоксіаденозінтріфосфат (дАТФ), дезоксігуанозінтріфосфат (ДГТФ), дезоксіцітозінтріфосфат (дЦТФ) і дезоксітімідінтріфосфат (дТТФ) - будівельний матеріал raquo ;, використовуваний Taq-полімеразою для синтезу другого ланцюга ДНК;
Буфер - суміш катіонів та аніонів в певній концентрації, що забезпечують оптимальні умови для реакції, і стабільне значення рН;
Аналізований зразок - підготовлений до внесення в реакційну суміш препарат, який може містити шукану ДНК, що служить мішенню для подальшого багаторазового копіювання (наприклад, ДНК мікроорганізмів) [14].
Циклічний температурний режим:
Хід реакції: зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20-35 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій:
. Денатурація. На першому етапі необхідно денатурировать ДНК, що знаходиться у зразку. Для цього реакційну суміш нагрівають до 92-95 ° С, в результаті чого дволанцюжкові молекули ДНК розплітаються з утворенням двох одноланцюгових молекул. Цей процес триває не менше 1 хвилини.
. Відпал. На другому етапі температуру суміші знижують до 55 ° С праймери приєднуються до одноцепочечной ДНК-мішені. Праймери вибирають так, що вони обмежують шуканий фрагмент і комплементарні протилежним ланцюгам ДНК.
Відпал відбувається відповідно до правилом комплементарності Чаргаффа.
. Елонгація (синтез). На третьому етапі температуру в реакційній суміші доводять до оптимуму роботи Taq-полімерази - 75 ° С, і починається синтез комплементарної ланцюга ДНК, ініційований 3 -гідроксільной групою праймера, з максимальною ефективн...
