групу рК а якої, кілька змінюється в Залежно від мікрооточення, близький до 4 (карбоксиметил (СМ)-похідні целюлози, сефадексе, містять угруповання
В
Карбоксильні групи таких іонітів негативно заряджені при рН 5 і вище і, отже, здатні зв'язувати білки, які в цих умовах несуть позитивний заряд. Зв'язування білків посилюється, якщо на їх поверхні зустрічаються скупчення ("грона") катіонних груп. При інших рівних умовах з катионитом краще зв'язуються білки більшою молекулярною маси, що пояснюється кооперативністю багатокрапкового взаємодії обширних ділянок поверхні такого білка з аніонними групами іонообмінника.
Десорбція білків, пов'язаних катионитом, зазвичай досягається підвищенням іонної сили елююють розчину, причому взаємодіючі між собою заряджені групи білка і ионита опиняються в оточенні протилежно заряджених іонів солей. В результаті при певній концентрації солі, характерною для кожного білка, електростатичні взаємодії між ним і іонітом знімаються і білок елююють з колонки. Плавне збільшення іонної сили розчину, застосування лінійного або більш складного градієнта концентрації солі викликає десорбцію спочатку найбільш слабко утримуваних молекул, потім більш міцно пов'язаних білків і т.д. У препаративних дослідах нерідко вдаються до ступінчастою елюції, при якій концентрації солі підвищується стрибками. Це прискорює поділ і дозволяє зібрати білок в невеликому обсязі, проте легко призводить до утворення одним і тим же білком декількох помилкових.
При промиванні колонки з іонітом розчином солі підходящої концентрації білок десорбується, іноді утворюючи досить довгий "Хвіст", що може бути наслідком нерівномірного розподілу іонних груп у сорбенті. Ділянки з їх підвищеним вмістом, скупчення таких груп міцніше утримують білок, що і викликає затримку елюції та освіта "Хвоста". У такій ситуації стрибкоподібне підвищення іонної сили елююють розчину різко покращує умови десорбції, тому частина білка, яка в звичайних умовах утворювала б "хвіст", десорбується стрибком, даючи помилковий пік.
Зважаючи на це слід визначати білковий склад кожної фракції незалежним методом, наприклад електрофорезом в поліакриламідному гелі, або піддавати сумнівні піки повторної хроматографії в тих же умовах. Недотримання таких пересторог нерідко призводить до помилкового виявленню "Множинних форм" білків. p> В принципі для десорбції білків з катіонітів можна вдаватися і до градієнту рН. Наприклад, зниження pH до 3-4 призводить до протонуванням карбоксилатних іонів карбоксиметилцелюлози або аналогічних іонітів і поступової десорбції пов'язаних з ними білків. Можна розраховувати і на досягнення ізоелектричної точки сорбованої білка, що знову-таки викликало б його десорбцію. Однак такий прийом використовують не часто не тільки через небезпеки денатурації білків при зниженні рН, а й через ускладнень, пов'язаних з сорбцією іонітом частини іонів елююють розчину і невизначеністю викликаються цим локальних змін рН. За такими ж міркувань не рекомендується використовувати в іонообмінної хроматографії білків розчини, що містять кілька різних катіонів або аніонів.
Крім карбоксильних катіонітів, про які йшла мова вище, застосовують катіоніти, містять сульфогрупи -, Наприклад
сульфопропілсефадекс. На відміну від карбоксильних сульфогрупи зберігають негативний заряд практично при всіх рН, що використовуються в хроматографії білків.
Іоногенні групи фосфоцеллюлози слабкіше, ніж у сульфопропілсефадекса, але сильніше карбоксильних. Виявилося, що цей ионообменник може застосовуватися в якості біоспецифічного сорбенту при виділенні деяких ферментів фосфорного обміну. ​​
Серед анионитов найбільшого поширення набули діетил-амііоетіл (DEAE)-целюлоза і її аналоги з іншими матрицями:
В
Діетіламіноетільная група, приєднана до целюлози або інший полисахаридной матриці.
Основність діетіламіноетільной групи в сорбентах цього типу трохи нижче звичайної через вплив оточуючих її гідроксильних груп, так що її р дорівнює 9,5. DEAE-целюлоза ефективна як аннонообменнік аж до рН 8,5 - 9,0. Аніоніти, що містять четвертинні амонійні групи, - QAE-сефадексе або QAE-сефароза-зберігають позитивний заряд і при більш високих рH.
Хроматографія білків иа DAEA-целюлозі і аналогічних Аніонні-тах, подібно хроматографії на катіонах, визначається многоточечним зв'язуванням негативно заряджених груп білка (насамперед карбоксильних) з катіонними групами іонообмінника. Як і при хроматографії на катіоніту, десорбції білків досягають підвищенням іонної сили елююють розчину, її можна проводити ступінчасто або із застосуванням градієнта концентрації солі. І в цьому випадку не рекомендують градієнти pH і використання розчинів, що містять різні аніони. Наприклад, при десорбції білків хлористим натрієм з DEAE-целюлози, врівноваженою ацетатним буфером, крім екранування різнойменно заряджених груп сорбенту...
