істю.
Всі реакції проводять в пробірках, занурених у термостат. Зміна температурного режиму і його підтримку здійснюється автоматично.
Перший цикл. ДНК-мішень фланкирована певними послідовностями. До зразком ДНК додають праймери (Р1 і Р2), ДНК-полімеразу Tag і чотири дНТФ. Тут кожна з новосинтезованих ланцюгів має набагато більшу довжину, ніж відстань від 3 -гідроксільной групи її праймера до кінцевого нуклеотиду послідовності, комплементарної друге праймеру.
У другому циклі двухцепочечную ДНК, що складається з вихідної і новосинтезованих ( довга матриця ) ланцюгів, знову денатурують, а потім отжигают з праймерами [13].
У третьому циклі всі гетеродуплукси, що утворилися раніше, одночасно піддаються денатурації і відпалу з праймерами, а потім реплеціруются. При відпалі праймери гибрідизуючою з комплементарними ділянками вихідних ланцюгів, а також довгих і коротких матриць.
У наступних циклах число коротких матриць стає все більше.
Таким чином, специфічні фрагменти, обмежені на кінцях праймерами, вперше з'являються в кінці другого циклу, накопичуються в геометричній прогресії і дуже скоро починають домінувати серед продуктів ампліфікації.
Ефект «плато»
Використовують для опису процесу накопичення продуктів ПЛР на останніх циклах ампліфікації. Залежно від умов і кількості циклів реакції ампліфікації, на момент досягнення ефекту плато впливають утилізація субстратів (дНТФ і праймерів), стабільність реактантов (дНТФ і ферменту) та ін.
Стадії постановки ПЛР:
Підготовка проби біологічного матеріалу
Ампліфікація
Приладове забезпечення
Детекция молекул РНК
Оцінка результатів реакції
Метод горизонтального електрофорезу
Метод вертикального електрофорезу
Метод гібрідізаціонних зондів
Контроль за проходженням реакції ампліфікації [12]
Глава 2. Онкомаркери в клінічній діагностиці
Онкозахворювання як причина смертності стоять на другому місці після серцево-судинної патології. Серед злоякісних новоутворень найбільш часто зустрічаються: рак легені - 27%, рак молочної залози - 18%, колоректальні пухлини - 12%. Витрати на лікування таких хворих можуть невиправдано зростати за рахунок несвоєчасної діагностики (в основному пізнього виявлення в неоперабельних стадіях) і відсутності післяопераційного моніторингу ефективності операції та хіміотерапії [17].
Визначення здійснюється двохетапним методом (зворотна транскрипція + ПЛР в реальному часі). На даний момент розроблені набори для визначення наступних РНК-онкомаркерів. А також визначенням в крові онкомаркерів методами імуноферментного (ІФА), іммунолюмінесцентного (ИЛА) радіоімунного (РІА) аналізу.
Онкомаркери - це специфічні білки, які продукують пухлинними клітинами, зміст яких в крові корелює з наявністю або прогресуючим зростанням злоякісної пухлини. В даний час немає ідеального маркера зі 100% специфічністю (тобто не обнаруживающегося у здорових) і 100% чутливістю (тобто обов'язково виявляється у всіх хворих навіть у початковій стадії раку).
Тому вони в жодному разі не повинні визначатися при масових обстеженнях безсимптомних пацієнтів в якості скринінгу на виявлення злоякісного росту. Тим не менше, існують маркери з досить високими специфічністю і чутливістю, що дозволяють застосовувати їх і для первинної діагностики у групах ризику або у мають симптоматику раку пацієнтів [15].
Цінність цитологічних методів діагностики раку не підлягає сумніву, але в 10 - 20% випадків біопсій не вдається отримати матеріал, що містить пухлинні клітини при наявності злоякісної пухлини. Недоступність ЯМР-томографії як масового методу діагностики для більшості пацієнтів в Росії не дозволяє візуалізувати пухлини внутрішніх органів і метастази розміром до 0.5 - 1см. У таких випадках тільки визначення онкомаркерів дає можливість вирішити діагностичні проблеми, особливо при визначенні їх у динаміці: приріст рівня онкомаркера за 1 - 2 місяці вдвічі навіть при початково нормальному рівні - вірна ознака росту пухлини.
Альфа-фетопротеїн (АФП) в сироватці
Зміст АФП в сироватці в нормі:
у дорослих - до 10 МО/мл;
у вагітних з 8 тижнів. його зміст підвищується і становить у II - III триместрі 28 - 120 МО/мл;
у новонароджених в першу добу життя - до 100 МО/мл.
АФП - онкомаркер, глікопротеїн, ...
