і білка відбувається заміщення утримуваних анионитом ацетат-іонів іонами хлору. Якщо елюція проводиться в слабокислих розчинах, десорбувати ацетат-іони, пов'язуючи протони, викличуть зрушення рH в лужний бік, що призведе до локальної зміни умов елюції і зробить процес важко контрольованим.
Останнім часом в хроматографії білків все ширше застосовують іонообмінники на основі гідрофільних органічних полімерів, одержуваних у формі кульок суворо однакового діаметра (10 мкм ) і володіють великою робочою поверхнею. Стандартність гранул таких іонітів знижує розмивання хроматографічних піків за рахунок відмінностей у часі дифузії білкових молекул всередині сорбенту - фактор, що обмежує ефективність звичайних іонообмінників з неоднаковими гранулами. Носії цього типу жорсткі, що дозволяє досягати досить високих швидкостей перебігу розчинів через колонку при тиску близько 20 атм. Спільна дія цих факторів різко підвищує ефективність та швидкість хроматографії білків на такого роду сорбентах, що отримала назву швидкої рідинної хроматографії білків (англійське скорочене позначення FPLC). У якості сорбентів використовують Moho-Q - сильний аніоніт з четвертинними амонійними групами, Moho-S - сильний катіоніт, що містить сульфогрупи, або Моно-P-катіоніт з фосфатними групами. br clear=all>
В
p> Очищення лужної фосфатази іонообмінної хроматографії:
1 - оптична щільність при 280 ні, відбиває загальний вміст білка; 2 - активність лужної фосфази;
А - поділу неочищеного препарату на аііоніте Моно-Q при рН 8 у градієнті концентрації NaCl 0-0.35 М (3):
Б - хроматофокусірованіе на Моно-Р лужної фосфатази, очищеної на попередній стадії в градієнті рН (4);
В - хроматографія фракції, виділеної на Моно-Р, на анионите Моно-Q в градієнті концентрації NaCl (5)
На жаль, до цих пір не вдалося розробити досить ефективний спосіб препаратівного електрофорезу білків в гелях, хоча їх аналітичне поділ електрофорезом в поліакркламідном гелі дає дуже хороші результати і є провідним методом у дослідженні білкових сумішей і індивідуальних білків.
Гідрофобна хроматографія білків
В
Як відомо, поверхня білкової глобули багата гідрофільними амінокислотами, але в той же час містить чимало (до половини від їх загального вмісту) гідрофобних залишків, нерідко утворюють скупчення ("грона"). Такі гідрофобні зони, розвинені в більшій чи меншій мірі, представляють характерну особливість структури кожного білка, на чому і грунтується метод гідрофобною хроматографії. Відповідні сорбенти синтезують, включаючи гідрофобні угруповання в гідрофільну матрицю, наприклад в поперечно-зшиту агарозу - сефароза. За таким принципом побудовані, зокрема, октіл-і фенілсефароза:
В
В
При пропущенні білкового розчину через фенілсефарозу гідрофобні ділянки поверхні білків утворюють контакти з фенільними групами, витісняючи прилеглі до цих структур молекули води. Число і міцність таких контактів досить різні у різних білків. Підвищенню їх міцності сприяє сорбція білків з концентрованих розчинів солей, наприклад сульфату амонію. Плавне зниження концентрації солі в розчині, що протікає через колонку з фенілсефарозой, призводить до почергової десорбції білків.
Подібним чином діють сорбенти, отримані приєднанням до макропористі кремнезему гідрофобних алкільних радикалів
різної довжини. Вони, будучи жорсткими, особливо підходять для роботи при підвищеному тиску в умовах високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ, англ. HPLC). Ті з них, які містять довгі - уг леводородние ланцюга, малопридатні для розділення білків через занадто сильного, нерідко незворотного зв'язування, ио можуть застосовуватися для хроматографії пептидів. Кращі результати дає хроматографія білків на сорбентах, що містять більш короткі - З 4 - вуглеводневі ланцюги.
Нерідко гідрофобна хроматографія поєднується з іншими ефектами. Наприклад, приєднання до активованої бромцианом сефарозе діамінів різної довжини дає сорбенти, в яких містяться гідрофобні вуглеводневі ланцюжка поряд з двома катіонними групами. Об'єднання чорт гідрофобного сорбенту і аніоніта в одному хроматографічному матеріалі збагачує його.
Описаний вище спосіб проведення хроматографії на гідрофобному сорбенті - далеко не єдино можливий. Для сорбції білків не обов'язково введення в розчин підвищених концентрація солі, а для елюцні можна застосовувати додавання органічних розчинників, зсув рН. У деяких випадках, коли зв'язування білка засновано на поєднанні гідрофобних та іонних взаємодій, хороші результати дає елюція розчинами солей. Відзначимо також, що ознаки гідрофобною хроматографії зустрічаються і в інших прийомах розділення білків, в особливості в афінної хроматографії.
Афінна, або біоспе...
