іншими словами, на заключному етапі блотинг аналогічний твердофазним імунологічним тестах. Після повторного відмивання лист нітроцелюлози поміщають в касету з рентгенівською плівкою для авторадіографії. На проявленої плівці видно смуги локалізації антигену, який зв'язав мічені антитіла. Метод більш зручний при використанні кон'югатів з ферментом. br/>
Принцип діагностики ГЕ ВРХ за допомогою імуноблотингу
Патологічна ізоформа пріонів білка (PrP Sc ) на відміну від усіх інших білків мозку стійка до протеїнази К. Це властивість використовується для його виділення: після обробки протеїназою До в пробі залишається тільки PrP Sc , якщо проба позитивна, або не залишається ніяких білків, якщо проба негативна.
Для визначення молекулярної маси білків проби після обробки протеїназою До проводять їх електрофорез в агарових або поліакриламідному гелі. Швидкість переміщення білків в гелі при електрофорезі залежить від їх заряду та молекулярної маси. З метою спрощення імунодетекції розділені в електрофорезі білки переносять з гелів на мембрану за допомогою процедури блотингу. Принцип її полягає в тому, що білки витягуються з гелю під дією електричного поля і відразу ж адсорбуються на мембрані. p align="justify"> Для визначення імунологічних властивостей перенесених на мембрану білків проводять обробку мембрани антитілами, специфічними до PrP Sc , потім промивають антивидові антитілами , міченими ферментом. При нанесенні на мембрану субстратної суміші вона розкладається ферментом з утворенням забарвленого або люмінесцирующего продукту реакції, залежно від виду застосовуваних ферментів і субстратні сумішей. Якщо на мембрані присутній PrP Sc , відбувається зв'язування з ним спочатку перших, а потім других антитіл. При розкладанні ферментом, коньюгированного з другим антитілом субстратної суміші, пофарбований, або люминесцирующий продукт реакції утворюється в місці розташування пріонів білка.
Таким чином, PrP Sc виявляється в иммуноблотинга з урахуванням трьох характеристик: стійкості до протеїнази К, певного розміру молекул при електрофорезі (27-30 kDa) і зв'язування зі специфічним антитілом.
Техніка постановки иммуноблотинга складається з наступних етапів:
Г? відбір проб;
Г? гомогенізація проби;
Г? ферментне руйнування проби;
Г? електрофорез;
Г?
